생체 영상에 적합한 이광자 소듐 표지자의 합성 및 물성연구
Sodium Ion Selective Two-Photon Fluorescent Probe for In Vivo Imaging
- 주제(키워드) 이광자 소듐 표지자
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 김환명
- 발행년도 2011
- 학위수여년월 2011. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 에너지시스템학부
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011495
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
소듐 이온은 생체 내에 다른 금속이온들에 비해 고농도로 존재하며 생리학 및 병리학적으로 중요한 역할을 한다. 소듐 이온을 관찰하는 것 또한 중요하기 때문에 이를 관찰하기 위한 형광 표지자의 합성 또한 활발히 이루어져 왔다. 하지만 지금까지 상용화 되어 있는 소듐 이온 표지자는 대부분이 일광자 형광 표지자(one-photon fluorescent probe)이며, 생체 내에서의 소듐의 작용을 실시간으로 관찰하기 어려운 단점을 가지고 있다. 또한 분자의 크기가 커서 세포에 염색이 어렵고, 짧은 파장영역의 excitation 파장을 필요로 하기 때문에 조직의 깊은 곳까지 관찰하는데 어려움이 있으며, 세포의 자가형광(autofluorescence) 및 photobleaching 현상을 유발시킨다. 이러한 단점들은 이광자 현미경(two-photon microscopy)을 이용하면 보완 할 수 있다. 이광자 현미경은 긴 파장영역의 낮은 에너지를 excitation 파장으로 이용하기 때문에 세포를 손상 시키지 않으며 살아있는 조직의 영상을 얻을 수 있다. 하지만 이러한 이광자 현미경에 적합한 이광자 형광 표지자(two-photon fluorescent probe)의 개발이 미흡하며, 더욱이 소듐 이온에 선택적인 이광자 형광 표지자는 개발이 되지 않았다. 이에 소듐 이온에 선택적인 이광자 형광 표지자를 합성 하기 위해, 이광자 형광 효율이 좋은 염료를 합성하고, 소듐 이온에 선택적으로 작용할 수 있는 수용체를 합성하여 염료와 결합시켜 표지자(ANa1)를 합성 하였다. 합성한 표지자는 광물리적 특성을 측정하여 생체 내에 적합한지를 확인하였고, 이후 세포와 조직에 적용해 이광자 현미경 이미지를 얻는 실험을 진행하였다. 결과적으로 ANa1은 생체 내에 존재하는 다른 금속이온의 영향을 거의 받지 않으며 소듐이온에 선택적으로 형광을 나타낸다. 또한 PET(photo-induced electron transfer) mechanism에 의해 turn-off/on 작용을 하며, 일광자 형광효율 및 이광자 형광효율은 상용화된 표지자(SBFI, Sodium Green)에 비해 큰 값을 가진다. 분자량 또한 작아 세포에 잘 염색이 되며, 이광자 현미경을 이용하면 살아있는 조직의 100-200 ㎛깊이의 소듐 이온 또한 관찰 할 수 있다. 이러한 소듐 이온에 선택적인 이광자 형광 표지자인 ANa1은 다양하게 응용이 가능할 것이다. 다른 금속이온과의 상호작용 등의 생명과학 현상의 관찰이 용이해질 것이며, 생체 내에서 소듐 작용의 확인을 통해 질병의 조기진단 및 진단시약과 치료제 개발 등에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
more초록/요약
Sodium ion plays critical roles in many physiological and pathological processes such as nerve conduction, muscle and heart contraction; it modulates the electrolyte level, cation transport, and cell volume. To understand these functions, a number of one-photon (OP) fluorescent probes have been developed, with SBFI and Sodium Green (SG) being commercially available. A disadvantage of these probes is that they are bulky and suffer from difficulties in loading into live cells. The second problem, which is common for most OP probes, is their short excitation wavelength (< 500 ㎚). This requirement limits their application in tissue imaging owing to the shallow penetration depth (< 100 ㎛), photobleaching, and cellular autofluorescence. An ideal solution to this problem is two-photon microscopy (TPM), which utilizes two near-infrared photons of lower energy for the excitation. TPM has the advantages of increased penetration depth (> 500 ㎛), localized excitation, and prolonged observation time. Using TPM, one can image intact tissue for a long period of time with minimum interference from tissue preparation artifacts that can extend more than 70 ㎛ into the tissue slice. However, there is no report on the TP probe for Na_(+) that is capable of imaging [Na+]_(i) deep inside living tissues. To address both of these problems, we designed a two photon (TP) probe (ANa1) derived from 2-acetyl-6-(dimethylamino)naphthalene (acedan) as the TP fluorophore and 1,7-diaza-15-crown-5 as the Na_(+) ion receptor by considering the following requirements; (i) small MW for cell permeability; (ii) high selectivity for Na_(+) ions; (iii) significant TP cross section for bright TPM image; (iv) large spectral shifts in different environments for discrimination between the cytosolic and membrane-bound probes; and (v) high photostability. Herein, we report that ANa1 is capable of detecting intracellular free Na+ ions in live cells and tissues at >100 ㎛ depth for a long period of time without mistargeting and photobleaching problems. ANa1 shows strong TPEF enhancement in response to Na_(+), a dissociation constant (Kdi) of 26 ± 2 ㎛ in the cell, can be easily loaded into the cells, and emits 3~5-fold larger TPEF than SG and SBFI upon complexation with Na_(+). Unlike the previously available probes, this novel probe can selectively detect [Na+]_(i) in live cells and living tissues at 100-200 ㎛ depth for more than 60 min using TPM.
more목차
Ⅰ. 서론 1
1. 이광자 형광 표지자 1
2. 생체 내 Na+ ion 4
3. 감응 메커니즘: Photo-induced Electron Transfer (PET) System 8
Ⅱ. 본론 10
1.기기 및 시약 10
2.ANa1의 합성 10
(1) 형광체의 합성 10
(2) Receptor의 합성 13
(3) ANa1의 합성 20
3.Photophysical properties of ANa1 21
(1) 용해도 측정 (Water solubility) 21
(2) 용매에 따른 Quantum Yield 측정 23
(3) Na+이온 농도에 따른 ANa1의 fluorescence intensity의 변화 25
(4) Na+이온과 K+이온농도 변화에 따른 absorption 및 emission spectra 26
(5) pH dependency 28
(6) 금속이온에 대한 선택성(selectivity) 29
(7) 이광자 형광효율 (δΦ/GM) 비교 30
(8) 이광자 형광 titration의 buffer 와 cell에서 비교 31
(9) ANa1, SBFI 및 Sodium Green의 photophysical 특성 비교 32
4. ANa1을 이용한 Two-photon Microscopy Bioimaging 33
(1) SBFI-AM, SG-AM 및 ANa1의 TPM images 33
(2) Astrocyte에서의 TPM image 35
(3) 세포 내에서의 Photostability 확인 37
(4) ANa1의 유용성(utility) 확인을 위한 응용실험 39
(5) ANa1을 이용한 조직(tissue) imaging 40
Ⅲ. 결론 42
Ⅳ. 참고문헌 43
Abstract 45
Spectrum 47
