근원세포의 증식과 분화과정에서의 신트로핀의 기능연구
Functional analysis of syntrophin during the proliferation and differentiation of muscle cells
- 주제(키워드) muscle cell , syntrophin
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 김혜선
- 발행년도 2011
- 학위수여년월 2011. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000011492
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Muscle cell differentiation is induced by depletion of growth factors, addition of differentiation-stimulating reagents, or reaching at a critical cell numbers. Muscle cell differentiation can be expressed as morphological differentiation and biochemical differentiation. In morphological differentiation, the depletion of growth factors terminates the cell cycle, then cells are aligned together, and they form multinucleated myotubes through spontaneous membrane fusion. Biochemical differentiation represents expression of a number of important proteins, known as myogenic regulatory factors (MRFs) including myoD, myogenin, MRF4, and myf5. These MRFs regulates transcription of various muscle proteins in the differentiation of myoblasts. Cell migration is an important event in many biological processes, including repair, embryogenesis, and regeneration. When cells are stimulated by a reagent that stimulates migration, they are polarized and subsequently extend protrusions in the direction of the movement. During migration, the actin-cytoskeleton is reorganized and lamellipodia form at the leading-edge of locomotion. Syntrophins are members of the dystrophin-associated protein (DAP) complex and serve as adaptor proteins for signaling molecules, between the cytoskeleton and surface membrane. Syntrophins contain two PH domains, a PDZ domain, and a SU domain, which are all involved in binding various signaling proteins and actin cytoskeleton. Dystrophin and syntrophins can be phosphorylated by various kinases in vivo and in vitro. In mature skeletal muscle, α-syntrophin is the major syntrophin isoform and it links signaling proteins to the sarcolemmal dystrophin complex. α-Syntrophin is expressed from the early stages of muscle differentiation. The function of syntrophin in the differentiating muscle cells has never been reported. The work aimed to study the function of α-syntrophin in the differentiation of myoblasts. First, we studied a role of α-syntrophin in the undifferentiating myoblasts. α-Syntrophin is expressed in both myoblasts and myotubes whereas dystrophin is expressed only in C2 myotubes at the membrane. Sol8 cells do not express dystrophin and α-sarcoglycan. In C2 and Sol8 cells, α-syntrophin was observed both in cytoplasm and membrane. The phosphorylated α-syntrophin was detected in the membrane-containing fraction of the undifferentiating myoblasts of both C2 and Sol8 cells. However, the phosphorylated α-syntrophin is not detected in the membrane fraction of C2 myotubes. In contrast, it can be detected in the membrane fraction of Sol8 myotubes. The protein kinase C modulated the phosphorylation of α-syntrophin and the interaction of α-syntrophin and dystrophin. In particular, the increased phosphorylation of α-syntrophin by protein kinase C blocked the interaction of α-syntrophin with dystrophin. These results suggest that dystrophin-associated α-syntrophin in membrane fraction is a non-phosphorylated form and the phosphorylation of α-syntrophin was modulated by protein kinase C. The migration of C2 cells was stimulated by hepatocyte growth factor (HGF). In migrating cells, syntrophins accumulated at the rear-lateral part, whereas they were diffusely located in the cytoplasm of C2 cell in non-migrating cells. LY294002, an inhibitor of PI3-kinase, reduced the rate of cell migration and altered the localization of syntrophins. Interestingly, neither α-syntrophin knock-downed C2 cells nor primary cultured myoblasts from α-syntrophin-knockout mice respond to HGF. In the α-syntrophin knock-downed C2 cells, phosphorylation of Akt on serine 473 residue is also reduced. These results suggest that α-syntrophin modulates HGF-induced muscle cell migration via PI3-kinase/Akt pathway. Myogenin is one of important MRFs especially in the early stages of muscle differentiation. The expression of myogenin in Sol8 cells was found to be delayed than in C2 cells. Myogenin expression was delayed and/or decreased in α-syntrophin knock-down C2 cells and the primary cultured myoblasts from the α-syntrophin-knockout mice. Conversely, myogenin expression was enhanced in α-syntrophin over-expressed Sol8 cells and primary cultured myoblasts from α-syntrophin over-expressing transgenic mice. During the early days in muscle regeneration after cardiotoxin injection, expression of myogenin in α-syntrophin knockout mice was relatively lower than that of normal C57 mice. α-Syntrophin was found in nuclei in C2 differentiating myoblasts but not much in Sol8 cells. α-Syntrophin is associated with Mixed-Lineage Leukemia 5 (MLL5), a known regulator of myogenin expression in C2 differentiating myoblasts. These results suggest that the α-syntrophin modulate the expression of myogenin by interaction with MLL5. The current study showed that α-syntrophin has several functions in differentiating myoblasts as well as in the matured myofibers. Taken together, these results further suggest that α-syntrophin may play a positive role in the repair of skeletal muscle and regeneration following exercise-induced injury or neuromuscular diseases such as muscular dystrophy.
more초록/요약
근원세포의 분화는 성장인자의 고갈이나 분화촉진물질의 증가 또는 세포의 농도에 의해 유도되며, 형태적인 분화와 생화학적 분화의 두 가지로 구성되어 있다. 형태적인 분화과정에서 성장인자의 고갈은 세포가 세포주기를 정지하여 세포분열을 멈추고 세포의 모양을 bipolar 하게 바꾸어 세포들이 나란히 배열하도록 한 후 신장하는 과정을 거쳐 최종적으로 세포들은 세포막의 융합을 통해 다핵의 근관을 형성하게 된다. 생화학적 분화는 다양한 근육조절인자(MRFs)에 의해서 조절되며, 각각의 유전자들은 분화의 특정 과정에서 발현하여 분화를 조절한다. 세포의 이동은 손상부위의 치유, 발생단계, 재생등의 다양한 생물학적인 과정에서 중요한 단계이다. 세포가 세포이동을 촉진시키는 신호를 받으면 세포는 극성을 띠게되고 많은 단백질들이 세포내 특정부분에 위치하면서 세포의 이동 방향을 향해 돌출부위를 형성하여 세포의 모양을 변화시킨다. 세포가 이동하는 동안 세포골격을 형성하는 actin은 재배열과정을 통해 lamellipodia를 세포이동의 leading edge방향으로 형성한다. Dystrophin 결합 단백질 (DAP) 복합체의 하나인 syntrophin은 세포골격과 신호전달 단백질들 사이에서 adaptor 단백질로서의 기능을 한다. Syntrophin은 두 개의 PH domain 과 하나의 PDZ domain 그리고 신트로핀 특유의 SU domain으로 이루어져 있으며 이들 domain들은 신호전달 단백질들, 세포골격의 actin과 상호작용하여 기능을 수행한다. Dystrophin과 syntrophin은 in vivo 와 in vitro 에서 다양한 kinase에 의해 인산화 되는것으로 알려져 있다. α-Syntrophin은 근육에서 주로 발현하는 syntrophin isoform으로 성숙한 근육에서 신호전달 단백질들을 sarcolemma의 dystrophin 복합체에 연결해주는 기능을 한다. 또한 α-syntrophin은 근육 분화 전의 근원세포와 초반 분화단계에서도 발현 한다. 분화하는 근육세포에서 syntrophin의 기능은 아직까지 보고되어 있지 않으므로 본 연구는 분화하는 근원세포에서 신트로핀의 기능을 밝히는 것을 목적으로 한다. 첫 번째로, 분화하지 않은 근원세포에서 α-syntrophin의 기능을 연구하였다. C2 근원세포주와 dystrophin 과 α-sarcoglycan을 발현하지 않는 Sol8 세포주를 이용하여 dystrophin의 발현을 확인 한 결과 dystrohpin은 C2 근원세포주의 근관 세포막에서만 발현하는 것을 확인 하였다. α-Syntrophin은 C2 와 Sol8의 근원세포와 근관세포 모두의 세포질부분과 세포막부분에서 발현 하였다. 인산화된 α-syntrophin은 C2 와 Sol8의 근원세포의 세포막을 포함한 분획에서 확인하였으며 C2 근관의 세포막을 포함한 분획에서는 인산화된 α-syntrophin을 확인할 수 없었다. 그러나 Sol8 근관에서는 인산화된 α-syntrophin을 세포막이 포함된 분획에서 확인 하였다. Protein kinase C의 활성은 α-syntrophin 의 인산화를 조절하였으며 α-syntrophin과 dystrophin의 결합을 조절하였다. 부분적으로 protein kinase C의 활성 촉진은 α-syntrophin의 인산화를 증가시켰으며 dystrophin과 α-syntrophin의 결합을 억제하였다. 이 결과들은 세포막에서 dystrophin과 결합한 α-syntrophin은 인산화되어 있지 않으며 α-syntrophin의 인산화는 protein kinase C 에 의해 조절되는 것을 보여주는 결과이다. C2 근원세포의 이동은 hepatocyte growth factor (HGF) 에 의해 촉진되며 이동하는 C2 근원세포에서 syntrophin은 rear-lateral part에 집중되어 위치하지만 이동하지 않는 C2 근원세포에서는 세포질 전체에 고루 분포하였다. PI3-Kinase억제제인 LY294002는 lamellipodia의 형성을 저해하여 세포의 이동을 억제시키고, LY294002에 의해 세포내 syntrophin은 세포질에 고루 분포하였다. 흥미롭게도 α-syntrophin이 knock-down된 C2 근원세포와 knockout mice의 근원세포는 HGF에 반응하지 않았다. siRNA를 이용하여 α-syntrophin을 knock-down시킨 C2 근원세포에서 HGF에 의해 Akt 의 473 serine 잔기의 인산화가 감소하는 것을 확인 하였다. 이 결과들은 α-syntrophin이 PI3-kinase/Akt 신호전달 체계를 경유하여 HGF에 의해 유도된 세포의 이동을 조절 할 수 있음을 보여준다. 근육분화의 초기단계에서 중요한 기능을 하는 근육조절인자 (MRF)로 알려진 myogenin은 C2에 비해 Sol8에서 발현 시점인 늦고 발현양이 적은 것을 확인하였다. α-syntrophin이 knock-down된 C2 근원세포와 α-syntrophin knockout mice로부터 분리한 근원세포에서 myogenin의 발현양은 감소하고 발현시점도 늦는 것을 확인 하였다. 반대로 α-syntrophin을 과발현 시킨 Sol8세포와 α-syntrophin을 과발현 시킨 α-syntrophin knockout mice에서 myogenin의 발현이 증가하고 발현시점이 앞당겨 지는 것을 확인 하였다. Cardio toxin을 주입하여 근육의 재생실험을 실행한 결과 근육재생의 표지단백질인 myogenin이 α-synsyntroph knockout mice에서 정상 C57에 비해 감소하였다. 분화하는 C2 근원세포에서 α-syntrophin이 핵에 위치하였으나 Sol8에서는 핵에 위치한 α-syntrophin이 적은 것을 확인 하였다. 근육세포의 분화가 진행되는 동안 α-syntrophin이 myogenin의 발현을 조절하는 것으로 알려진 Mixed-Lineage Leukemia 5 (MLL5) 와 분화의 특정 시점에서 결합하는 것을 확인 하였다. 이 결과는 α-syntrophin이 MLL5와 의 결합을 통해 myogenin의 발현을 조절 하는 것을 보여준다.본 연구는 α-syntrophin이 근원세포의 분화와 성숙된 근관에서 다양한 기능을 수행 할 수 있음을 제시함과 동시에 α-syntrophin이 근육의 회복 및 근육의 운동이나 신경근육계의 질환으로 인한 근육의 손상을 재생하기 위한 촉진제로서의 가능성을 제시한다.
more목차
I. Introduction 8
A. Skeletal muscle differentiation 8
B. Duchenne Muscular Dystrophy 12
C. Dystrophin Associated Proteins 13
D. Syntrophin 19
1. Syntrophin 19
2. Phosphorylation of syntrophin 22
E. Cell migration 23
F. Muscle regeneration 29
G. The purpose of this study 33
II. Materials and Methods 34
A. Materials 34
B. Primary muscle cell culture 35
C. Cell culture and fusion index 35
D. Fractionation of cells 35
E. Isolation of nuclei fraction 36
F. Immunoblot assay 36
G. Immunoprecipitation 37
H. Cardiotoxin injection 37
I. Muscle homogenization 37
J. Immunofluorescence assay 38
K. In vitro phosphorylation 38
L. RT-PCR 38
M. Transfection of α-syntrophin specific siRNA 39
N. Transfection of α-syntrophin cDNA 39
O. Cell migration assay of C2 cells 39
P. Three-dimensional migration assay 40
Q. Statistical analysis 40
III. Results 41
A. Syntrophins expressed in mypblasts and myotubes 41
B. Syntrophin isoforms are localized in the cytoplasm and membrane fractions 46
1. Syntrophins differentially expressed in C2 and Sol8 cells 46
2. The localization of syntrophin is modulated by the cellular concentration and medium composition 49
C. Phosphorylated α-syntrophin is concentrated in myoblasts 53
D. Phosphorylation of α-syntrophin modulated the formation of dystrophin-associated protein complex 56
E. Hepatocyte growth factor induced migration of C2 cells 60
F. α-syntrophin accumulates in the rear part of migrating cells 63
G. α-syntrophin interacts with PTEN 66
H. Expression of α-syntrophin modulates cell migration 69
I. PI3-Kinase and migration 74
J. Role of α-syntrophin in muscle differentiation 78
K. α-syntrophin in C57 and α-KO primary cells 85
L. Role of α-syntrophin in skeletal muscle regeneration 92
M. α-syntrophin regulates myogenin expression 96
IV. Discussion 101
A. Syntrophin in myoblasts 101
B. Syntrophin in migration and regeneration 104
C. Syntrophin in differentiation 108
V. References 112
VI. Abstract in Korean 126
