Polyamine과 prothrombin kringle-2 에 의한 신경세포와 미세아교세포의 사멸기전에 관한 연구
Studies on the Mechanism of Polyamine-and Prothrombin kringle-2-induced Degeneration of Neuron and Microglia
- 주제(키워드) 미세아교세포 , 신경세포
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 Baik, Eun-Joo
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010888
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Neural cell death is the defining feature of all neurodegenerative diseases and is the underlying cause of many functional deficits. Clarifying the mechanism of cell death in the nervous system is essential to understand disease pathology and to devise effective treatment strategies. Increasing evidence has linked chronic inflammation to a number of neurodegenerative disorders including Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD). In the central nervous system, microglia, the resident innate immune cells play major role in inflammatory process. Microglia may directly toxic to neurons by releasing various substances such as inflammatory cytokines. Thus, it is pathophysiologically important to understand how the extent and duration of brain inflammation is controlled in vivo. In addition to down-regulation of inflammatory mediators, the extent and duration of inflammation in the CNS may be controlled by the removal of activated microglia. Therefore, this study shows the degeneration mechanism of dopaminergic neuron and the rolls of activated microglia to provocation or prevention of neuronal cell death. Recently polyamines have been also implicated in cell death. I examined whether polyamines, endogenous ligand for transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), could mediate 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced Mesencephalic Dopaminergic (DA) Neurons In vivo and In Vitro. Intranigral injection of the 6-OHDA into the rat brain, or treatment of rat mesencephalic cultures with 6-OHDA, resulted in cell death of dopaminergic (DA) neurons, as visualized by immunocytochemistry. This in vivo and in vitro effect was prevented by the -difluoromethylornithine (DFMO), an inhibitor of polyamines biosynthesizing enzyme ornithine decarboxylase (ODC), suggesting the direct involvement of Polyamines in neurotoxicity. TRPV1 antagonist capsazepine (CZP) reversed 6-OHDA-or polyamines-induced loss of DA neurons in vivo and in vitro, indicating TRPV1-mediated neurotoxicity. Western blot analysis also showed that pretreatment with DFMO reversed 6-OHDA-induced downregulation of phosphorylated Akt and upregulation of cleaved caspase-3 in mesencephalic cultures. This result is the first to show that 6-OHDA-polyamines-TRPV1 signaling pathway exerts neurotoxicity on dopaminergic neurons in vivo and in vitro. Prothrombin kringle-2 acts as an proinflammtory agent that activates microglia to release pro-inflammatory mediators. Intracortical injection of pKr-2 caused significant loss of cortical neurons in vivo after seven days, as evident from Nissl staining and immunohistochemical analysis using the neuronal-specific nuclear protein (NeuN) antibody. In parallel, pKr-2-activated microglia and ROS production were observed in rat cortex displaying degeneration of cortical neurons. Reverse transcription-PCR at various time points after pKr-2 administration disclosed early and transient expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and proinflammatory cytokines, such as interleukin 1β (IL-1β). Co-localization of iNOS, IL-1β, and TNF-α within microglia was evident with double-label immunohistochemistry. Additionally, pKr-2 induced upregulation of cytosolic components of NADPH oxidase (p67phox), translocation of cytosolic p67phox protein to the membrane, and p67phox expression in microglia in the cortex in vivo, signifying NADPH oxidase activation. The pKr-2-induced oxidation of proteins and loss of cortical neurons were partially inhibited by DPI, an NADPH oxidase inhibitor, and trolox, an antioxidant. Consistent with my hypothesis, following treatment with pKr-2 in vitro, neurotoxicity was detected exclusively in co-cultures of cortical neurons and microglia, but not in microglia-free neuron-enriched cortical cultures, indicating that microglia are required for pKr-2 neurotoxicity. My results strongly suggest that pKr-2 as an endogenous compound participates in cortical neuron death through microglial NADPH oxidase-mediated oxidative stress. Therefore, inhibition of microglial NADPH oxidase activation may offer prospective clinical therapeutic benefit for neuroinflammation-related neurodegenerative disorders. How to minimize brain inflammation is pathophysiologically important, since inflammation induced by microglial activation can exacerbate brain damage. Thus, Death of activated microglia could act as a critical mechanism for the resolution of brain inflammation. Microglia cell death was detected at eight days after co-treatment of pKr-2 with IL-13/IL-4 in vitro. This cell death assessed by live and dead assay, TUNEL and MTT assay. Interestingly, superoxide assay, WST-1 show significantly increased reactive oxygen species (ROS) in combination of pKr-2 and IL-13 or IL-4 treated microglia. Additionally, the IL-13/IL-4-enhanced ROS were partially inhibited by an NADPH oxidase inhibitor. The IL-13/IL-4 induced cell death of microglia were partially inhibited by an NADPH oxidase inhibitor and by an antioxidant. Therefore, I hypothesized that the effects of IL-13/IL-4 and NADPH oxidase-derived ROS production may be linked to death of activated microglia. Moreover, Western blot analysis show significantly increased Cyclooxygenase-2 (COX-2) expression in combination of pKr-2 and IL-13 or IL-4 treated microglia. The IL-13/IL-4-enhanced COX-2 expression were partially inhibited by an NADPH oxidase inhibitor and an antioxidant. Additional studies demonstrated that microglia cell death was reversed by treatment with NADPH oxidase inhibitor, antioxidant, and COX-2 inhibitor. To my knowledge, This result is the first to demonstrate that IL-13/IL-4 induced cell death of pKr-2 activated microglia is mediated by oxidative stress and COX-2 through NADPH oxidase.
more초록/요약
퇴행성 뇌 질환의 주요원인은 신경세포 사멸이라 할 수 있다. 따라서 신경세포 사멸의 기전을 밝히는 것은 뇌 질환의 과정을 이해하고 중재하는 하는 방법을 가능하게 할 것이다. 뇌의 염증반응은 퇴행성 뇌 질환의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. 뇌의 면역세포로 잘 알려진 신경교세포인마이크로글리아는 염증 매개물질들을 생성하는데 이러한 염증매개물질들은신경세포사멸의 한 원인으로 작용하고 있다. 또한 뇌의 생체항상성을유지하기 위해서는 활성화된 신경교세포는 항 염증반응 사이토카인 (antiinflammatory cytokine)들에 의해 제어되어야 한다. 따라서 본 연구는 파 킨 슨 병 에 서 일 어 나 는 도 파 민 신 경 세 포 사 멸 기 전 연 구 와 더 불 어 활성화된 신경교세포 가 신경세포 사멸 및 사멸방지에 관련된 작용 기전을조사하였다. 최근연구결과에 의하면 p o l y am i n e 은 신경세포 사멸을 유발시킨다고 알려졌다. 체내 또는 시험관내의 사멸은 polyamine 의 생합성 효 소 인 o r n i t h i n e d e c a r b o x y l a s e ( O D C ) 의 반 응 억 제 제 인 α-difluoromethylornithine (DFMO)의 처리에 의해 보호되는 것을 관찰하였다. TRPV1 길항제인 capsazepine (CZP)에 의하여 6-OHDA 와 polyamine 에 의한 도파민 신경세포의 손상이 억제되는 것을 보아, TRPV1 활 성 이 도 파 민 신 경 세 포 독 성 에 관 여 하 는 확 인 할 수 있 었 다 . 또 한 중뇌신경세포 배양에 DFMO 를 전 처리한 후 6-OHDA 를 처리 하였을 때6-OHDA 만 처리한 경우와 다르게 인산화된 Akt 의 증가와 caspase-3 의 억 제 를 w e s t e r n b l o t 으 로 확 인 하 였 다 . 이 실 험 결 과 로 중 뇌 신경세포배양에서 도파민 신경세포의 신경독성에 관여하는 6-OHDApo l y a m i n e s - T R P V 1 간 신호전 달 체계 를 처 음으로 확인하였다. 프로쓰롬빈 크링글-2 는 염증을 유발시킬 수 있는 물질로 뇌의 면역반응에 관여하는 마이크로글리아를 활성화 시켜 염증매개물질들을 유발시킨다고 알려졌다. 프로쓰롬빈 크링를-2 의 증가는 주로 혈장내 프로쓰롬빈으로부터 나오지만 여러 보고들에 의하면 뇌에서도 프로쓰롬빈의 전사체가 발현 되어지고 손상이 일어났을 때 쓰롬빈의 양이 증가하는 것처럼 프로쓰롬빈 크링를-2 의 생성이 증가된다고 볼 수 있다. 프로쓰롬빈 크링를-2 을해마대뇌피질에 주입하였을 때 강한 마이크로글리아의 활성화를 면역화학염색법을 통해 관찰할 수 있었고, 활성화된 마이크로글리아에서 염증반응을 유발시킬 수 있는 물질들의 발현을 관찰할 수 있었다. 또한 프로쓰롬빈 크링글-2 에 의해서 NADPH oxidase의 구성요소 (p47 ^(phox), p67^(phox))의 발현이 증가되고, p67^(phox)가 마이크로글리아에 위치하고, NADPH oxidase의 활성화에 필요한 p67^(phox)의 세포질로부터 세포막으로의 이동을 관찰하였다. 프로쓰롬빈 크링글-2 에 의한 활성산소의 생성을 대뇌피질에서 관찰하였다. 이런 일련의 과정을 통해 만들어진 활성산소에 의해서 단백질의산화와 신경세포의 사멸이 유발된다는 것을 NADPH oxidase저해제, 항산화제를 사용하여 검증할 수 있었다. 이 결과를 통해 프로쓰롬빈 크링글-2 에 의한 신경세포사멸은 마이크로글리아의 활성화에 의한 세포독성을 유발시킬 수 있는 물질의 생성증가와 세포변성을 일으키는 활성산소의 생성을 통해 일어난다는 것을 확인하였다. 따라서, 과도한 마이크로글리아와 NADPH oxidase활성화를 저해하면 산화적 염증반응을 통해 일어나는 세포사멸을 억제할 수 있을 것이다. 과도하게 활성화된 마이크로글리아의 염증반응을 조절하는 기전은 매우 중요하고 필요하다. 뇌의 염증반응을 조절하는 중요한 기전 중의 하나는 활성화된마이크로글리아의 사멸이다. 프로쓰롬빈 크링글-2 에 의해 활성화된마이크로글리아에 Interleukin-13 이나 Interleukin-4 를 같이 처리하였을때 8 일째 마이크로글리아의 사멸을 관찰하였다. 흥미롭게도 프로쓰롬빈크링글-2 를 단독 처리하였을 때 보다 Interleukin-13 이나 Interleukin-4 를 프로쓰롬빈 크링글-2 와 함께 처리 하였을때 활성산소가 더 증가되는것을 확인하였다. 게다가 Interleukin-13 이나 Interleukin-4 가 증가시킨활성산소는 NADPH oxidase 의 반응억제제인 apocynin 에 의해 감소되는것을 확인하였다. Interleukin-13 이나 Interleukin-4 에 의한 마이크로글리아의 사멸은 NADPH oxidase 의 저해제와 항산화제 에 의해감소되는 것을 관찰하였다. 프로쓰롬빈 크링글-2 와 Interleukin-13 이나Interleukin-4 를 같이 처리하였을 때 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 가 증가하였다. NADPH oxidase 의 저해제와 항산화제 에 의해 Interleukin-13 이나 Interleukin-4 에 의해 증가된 COX-2 의 증가는 감소되었다. COX-2 저해제를 처리하였때 Interleukin-13 이나 Interleukin-4 에 의한 마이크로글리아의 사멸이 감소되는 것을 관찰하였다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II. MATERIALS AND METHODS 16
A. METHODS 16
1. Sterotaxic surgery and drug injection 16
2. Tissue preparation and immunohistochemistry 16
3. Double-immunofluorescence staining 18
4. Live and dead assay 19
5. MTT Reduction Assay 19
6. TdT-mediated dUTP Nick-EnD Labeling (TUNEL) assay 20
7. Immunocytochemistry 20
8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 21
9. Western blot analysis 21
10. In situ detection of O2- and O2- -derived oxidants 23
11. Detection of protein oxidation 24
12. Measurement of ROS Generation 25
13. Primary culture of cortical neuron, drug treatement, and assessment neuronal cell death 25
14. Primary culture of dopaminergic neuron, drug treatement, and assessment neuronal cell death 26
15. Cortical Microglia Cultures 27
16. Co-cultures of microglia and neurons 27
17. ODC enzyme activity assay 28
18. Dopamine (DA) uptake assay 28
19. Measurement of the densities of the immunoblot bands 29
20. Determination of NO 29
21. Quantification of TNF- Release 29
22. Statistical analysis 29
III. RESULTS 30
PART I. DFMO, Ornithine Decarboxylase Inhibitor, Prevents 6- hydroxydopamine-Induced Neurotoxicity in Rat Mesencephalic Dopaminergic Neuron 30
1. Polyamine depletion protects on 6-OHDA-induced neurotoxicity of dopainergic neurons in neuron-enriched mesencephalic culture 30
2. ODC activity in neuron-enriched mesencephalic culture exposed to 6-hydroxydopamine (6-OHDA) 34
3. Spermidine and Spermine induces neurotoxicity of dopaminergic neurons in neuron-enriched mesencephalic culture 36
4. Polyamines and 6-OHDA induces loss of dopaminergic neurons through TRPV1 in neuron-enriched mesencephalic culture 38
5. Effects of DFMO on the phosphorylation of AKT and activation of caspase-3 in neuron-enriched mesencephalic culture exposed to 6-OHDA 40
6. Depletion of Polyamines rescue dopaminergic neurons in the SN from 6-OHDA-induced neurotoxicity in vivo 42
PART II. Prothrombin kringle-2-induced oxidative stress contributes to the death of cortical neurons in vivo and in vitro:Role of microglial NADPH oxidase. 45
1. pKr-2 induces microglial activation and proinflammatory cytokines in the cortex in vivo 45
2. pKr-2 stimulates NADPH oxidase-mediated production of ROS by activated microglia in the cortex 51
3. NADPH oxidase contributes to pKr-2-induced neurodegeneration in the cortex in vivo 56
4. pKr-2 induces cortical neuron death in co-cultures of neuron and microglia.58
PART III. IL-13/IL-4 regulate oxidative stress via activation of NADPH oxidase and cell death of microglia in Prothrombin kringle-2-treated microglia culture 61
1. IL-13/IL-4 induced cell death of cultured rat microglia 61
2. Interleukin-13/-4 enhances the NADPH Oxidase-Mediated Production of ROS in pKr-2 treated microglia cultures 64
3. NADPH oxidase contributes to IL-13/IL-4-induced death of activated microglia In vitro 66
4. Interleukin-13/-4-enhanced COX-2 contributes to microglia cell death mediated by the NADPH oxidase-mediated production of ROS 69
IV.DISCUSSION 72
V.CONCLUSION 87
REFERENCES 88
국문요약 141
