의료생체응용을 위한 헤파린이 고정화된 스타형 고분자에 관한 연구
Heparin Bound Star-Sahped Polymers for Biomedical Applications
- 주제(키워드) Heparin , Tissue Engineering , Cardiovascular application , Coating material , star-shaped polymer
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 Park, Ki Dong
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010876
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Heparin, a sulfated polysaccharide belonging to the family of glycosaminoglycans, has numerous important biological activities that are associated with its interaction with diverse proteins. Therefore, various techniques available for the utilization of heparin…s activity in conjunction with biomaterials such as blood-contacting materials and tissue regeneration scaffold include: heparin dispersion, ionic binding, and covalent immobilization. However, a disadvantage of ironically bound and physically dispersed systems is that the heparin is continuously depleted with time, thereby limiting the effective duration of such biomaterials. And, several immobilization approaches of heparin showed low heparin activity and stability. The objects of all of the chapters of this dissertation are to develop a novel blood or cell compatible biomaterials immobilized with heparin using various polymeric biomaterials and effective coupling chemistry. Chapter 1 provides the general background for understanding of the objects. Also, this chapter describes overall objectives. In Chapter 2, star-shaped PLA-heparin (sPLA-Hep) was prepared by coupling heparin to the star-shaped PLA (sPLA) reaction using carbonyldiimidazole (CDI) chemistry. Hydroxyl groups of sPLA were activated by CDI for the reaction with the remained amino-terminal groups of heparin. The surface heparin content of sPLA-Hep was measured to be 1.43㎍/㎝². sPLA-Hep coated surface has shown higher hydrophilicity than control surface. The clotting time of sPLA-Hep measured by activated partial thromboplastin time (APTT) was significantly prolonged as compared to sPLA and linear PLA-heparin (PLA-Hep). sPLA-Hep surface demonstrated lower protein adsorption and platelet adhesion than control sPLA surface. In addition, fibroblast culture on the sPLA-Hep surface showed the enhanced cell spreading area compared with the sPLA surface. Obtained results suggest that the incorporation of heparin to sPLA is effective in curtailing the surface induced-thrombosis and in manipulating the cell interaction. sPLA-Hep could be applied as blood/tissue compatible biodegradable materials for implantable medical devices and tissue engineering. In Chapter 3, a novel cell-supporting scaffold, Tetronic-PLA-heparin (TLH) hydrogel, was prepared for improving tissue regeneration by coupling heparin to polymerized Tetronic-PLA (poly(L-lactide)). Aqueous TLH solutions showed thermo-sensitive behavior, demonstrating potential for injectable hydrogel. The content and the activity of conjugated heparin were determined to be 0.61 g per gram of total polymer and 67.2% of intact heparin activity, respectively. The basic fibroblast growth factor (bFGF) binding assay presented relatively high bFGF affinity of TLH hydrogel, which indicates applicability for growth factor delivery. Finally, chondrocyte culture on hydrogels revealed that the cell viability and the amount of synthesized glycosaminoglycan (GAG) for TLH hydrogel were higher than those for alginate gel. In Chapter 4, a novel method of immobilizing heparin on a 316L stainless steel substrate through a tyramine/dopamine conjugated bifunctional PEG was used to yield easily and rapidly well-defined surfaces with low non-specific protein adsorption and high anticoagulant activity. Surface immobilization of PEG and heparin onto 316L SS metal substrates has been established for improving its blood compatibility through the antifouling effect of PEG chain and antithrombogenic effect of heparin chain that prevents initial blood clotting in the blood stream. Tyramine functionalized PEG grafted surface was simply prepared via a mussel adhesive mechanism of catechol groups. And then, tyramine-functionalized heparin was rapidly immobilized within 5 min under physiological conditions using HRP and H²O² as catalysts for enzymatic oxidative reaction. The immobilized heparin on the substrate maintained as efficient amount (2 ~ 2.5 ㎍/㎝²) and its related bioactivity (50 ~ 60%) after 60 days immersion in physiological condition. In vitro study demonstrated that heparin-PEG surface has a significant effect on the protein adsorption of the albumin and fibrinogen and consequently the platelet adhesion and activation. On the basis of obtained results, PEG and heparin immobilized substrate using our technique can be applied to various cardiovascular devices such as stent that require improving blood compatibility. In addition, we suggest that the rapid crosslinking between tyramine conjugated PTD-SS and other phenol-functionalized molecules such as peptide-tyrosine have enough potential as a superior coating process for providing the site-specific function for biomedical application.
more초록/요약
헤파린은 글리코스아미노글라이칸 계열 황화 다당류의 일종이며, 다양한 단백질과의 상호작용을 통해 수많은 중요한 생물학적 활성을 나타낸다. 따라서, 이러한 헤파린의 활성을 혈액에 접촉하거나 조직 재생에 사용되는 생체재료에 응용하기 위해 단순분산, 이온결합, 혹은 공유결합을 이용한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 그러나, 기존에 보고된 단순분산 혹은 이온결합시스템에 의해 도입된 헤파린은 시간에 따라 급격하게 방출되고 그 효과를 장기간 유지하는데 있어 한계가 있다. 그러한 단점을 해결하고자 공유결합을 통해 결합된 헤파린은 그 안정성이 떨어지며, 고유의 활성이 급격하게 떨어지는 경향을 보여주고 있다. 본 논문에서는 다양한 고분자재료 및 효과적인고정화 방법을 이용하여 헤파린이 결합된 새로운 혈액/세포적합성 생체재료를 설계하고 그 특성을 평가하였다. 제 1 장에서는 전반적인 연구의 목적을 요약하고, 각장에 따른 연구목적의 이해를 돕기 위한 일반적인 배경지식을 수록하였다. 제2 장에서는 CDI (carbonyldiimidazole) 화학결합을 이용하여 헤파린이 고정화된 스타형의 생분해성 고분자 (sPLA-Hep)의 개발에 관한 연구내용을 기술하였다. 스타형의 고분자 말단 하이드록실기를 CDI 에 의해 활성화시킨 후 헤파린의 아민기와 결합하는 방법을 설계하였다. 이렇게 합성된 sPLA-Hep 는 유기용매에 의해 코팅이 가능하며, 코팅된 표면의 헤파린 정량값은 1.43 ㎍/㎝² 으로 측정되었으며 헤파린의 결합으로 인해 코팅된 표면은 헤파린이 결합되지 않은 표면에 비해 친수성이 증가함을 확인하였다. APTT 테스트를 통해 측정된 응혈시간은 sPLA 및 선형의 PLA-Hep 에 비해유의 하게 증가함을 확인함으로써 고정화된 헤파린의 향상된 활성을 검증하였다. sPLAHep코팅 표면은 비교군인 sPLA 코팅 표면에 비해 낮은 단백질 흡착률과 혈소판점착률을 보임으로써 향상된 혈액적합성을 나타내었다. 게다가 섬유아세포를 표면에서 배양한 경우 세포의 활성이 증가함으로써 세포적합성 또한 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 헤파린이 고정화된 sPLA 표면은 세포와의 상호작용을 보완하고 표면의 응혈효과를 효과적으로 감소시킴으로써 의료용 이식재 혹은 조직공학용 재료로 응용되는 생분해성 재료로 응용될 수 있음을 보였다. 제 3 장에서는 조직 재생을 위한세포 지지체로써 헤파린이 결합된 온도감응성 생분해 고분자 (Tetronic-Polylactideheparin,TLH)의 개발에 대한 연구내용을 기술하였다. 합성된 TLH 고분자는 중간에 에스터 고분자를 도입함으로써 분해가 가능하도록 설계되었으며, 수용액에 용해되어 온도감응성을 가짐으로써 주입형 하이드로젤로 응용이 가능하다. TLH 고분자에 도입된헤파린은 분자당 약 61%를 차지하고 있었으며, 아무것도 결합되지 않은 헤파린에 비해67.2%의 활성을 나타냄을 확인하였다. 일정 농도의 TLH 용액은 체온에서 졸상태와 겔상태가 변화하는 온도감응성을 나타냄을 보였다. 이렇게 제조된 하이드로젤은 헤파린과 섬유아세포성장인자와의 특이적인 상호작용에 의해 보다 높은 친화력을 보였으며, 서방형의 방출 경향을 나타내었다. 또한 연골세포를 하이드로젤 내에서 배양한 결과 비교군인 알지네이트젤에 비해 높은 세포 생존률 및 활성을 나타내어 조직 재생용 지지체로서의 가능성을 확인하였다. 제4장에서는 낮은 단백질 흡착률과 높은 항혈전성을 나타낼 수 있도록 금속표면에 폴리에틸렌글리콜 (Poly(Ethyleneglycol), PEG)와 헤파린을 고정화하는 새로운 방법을 제시하였다. 표면에 도입된PEG 는 항부착효과에 의해 단백질의 흡착을 저해하고, 그 위에 고정화된 헤파린은 혈류속에서 항혈전 효과를 나타냄으로써 표면의 혈액적합성을 증가시킬 수 있다. 말단이 각각 타이라민 (Tyramine, TA)과 도파민 (Dopamine, DA)로 개질된 PEG 는 상온에서 쉽게 금속표면에 도입되었고, TA 가 도입된 헤파린과 효소에 의해 5 분 이내에 빠르게 결합하였다. 이를 통해 표면에 도입된 헤파린은 다양한 조건 하에서 2~2.5㎍/㎝²의정량값 및 50~60 %의 활성도를 나타내었고, 이는 생리 조건 하에서 60 일 이상유지되는 것을 확인하였다. PEG 와 헤파린이 도입된 금속 표면은 유의하게피브리노겐과 알부민의 흡착을 감소시켰고, 또한 혈소판의 점착 및 활성화를 방지됨을 통해 증가된 혈액적합성을 가짐을 확인하였다. 이상의 연구를 통해 PEG 와 헤파린을 쉽고 빠르게 표면에 도입하는 상기 기술은 스텐트와 같은 혈액접촉 의료기기에 향상된 혈액적합성을 부여하는 것이 가능함을 알 수 있었다. 더불어, PEG-TA 가 표면에 고정된 표면은 페놀그룹을 보유한 생리활성물질(예를 들어, 타이로신 (Tyrosine)을 갖는 일부펩타이드)과 효소에 의해 빠르고 쉽게 코팅됨으로써 각 의료 용도에 맞는 맞춤형기능을 제공할 수 있는 가능성을 보였다. 이상의 연구를 통해 개발된 헤파린이 결합된 새로운 생체재료들은 기존의 생분해성 코팅시스템, 조직공학용 스캐폴드 및 하이드로젤, 성장인자 전달체 및 금속 코팅 시스템에서 향상된 혈액 및 세포적합성을 보임으로써 생체의료 분야에서 다양하게 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
more목차
Chapter 1. General Introduction 1
1.Biomaterials 2
1.1. Polymeric Biomaterials 5
1.2. Biodegradable Polymers 6
1.2.1.Poly(L-lactide) (PLA) 7
1.3.Hydrogels 10
1.3.1.Applications of hydrogels 10
1.3.2.Thermosensitive hydrogel 12
1.3.3.Tetronic ⓡhydroge l 13
1.4. Poly(ethylene glycol) (PEG) chemistry 16
2.Biomaterial-body interaction at the biointerface 19
2.1. Blood contacting biomaterials with hemocompatibility 19
2.1.1.Coagulation pathway 20
2.1.2.Protein adsorption at the initial response 23
2.1.3.Intrinsic pathway and extrinsic pathway 25
2.1.4.Platelet-surface interaction 26
2.2. Tissue engineering with cell compatibility 29
2.2.1.Importance of extracellular matrix like functionality 30
2.2.2.Importance of drug delivery functionality 33
3.Heparin 35
3.1. Structure of heparin 35
3.2. Medical importance of heparin 38
3.3. Regulating blood coagulation of heparin 40
3.4. Interaction of heparin with protein 45
4.Heparin conjugation for enhancing biocompatibilities 49
5.Overall objectives 50
6.References 51
Chapter 2. Heparin Conjugated Star-shaped PLA for Improved Biocompatibility 61
1.Summary 62
2.Introduction 63
3.Materials and Method 66
3.1. Materials 66
3.2. Preparation of sPLA-Hep 66
3.3. Characterization of sPLA-Hep 70
3.4. Quantitative analysis of heparin 70
3.5. Activated partial thromboplastin time (APTT) assay 70
3.6. In vitro plasma protein adsorption 71
3.7. In vitro platelet adhesion 72
3.8. In vitro cell culture and cell growth assay (actin staining) 72
4.Results and Discussion 74
4.1. Synthesis of sPLA-Hep 74
4.2. Quantitative analysis of heparin 76
4.3. Activated partial thromboplastin time (APTT) assay 76
4.4. In vitro plasma protein adsorption and platelet adhesion 77
4.5. In vitro cell culture 80
5.Conclusion 82
6.References 83
Chapter 3. Tetronic-PLA-Heparin Hydrogel as a Multi-Functional Scaffold for Tissue Regeneration 85
1.Summary 86
2.Introduction 87
3.Materials and Method 90
3.1. Materials 90
3.2. Synthesis of Tetronic-PLA (TL) copolymer 90
3.3. Heparin coupling to TL copolymer 91
3.4. Characterization of Tetronic-PLA-heparin (TLH) conjugate 93
3.5. Sol-gel transition behavior 93
3.6. Quantitative analysis of conjugated heparin 93
3.7. Activated partial thromboplastin time (APTT) assay 94
3.8. Basic fibroblast growth factor (bFGF) affinity and release profiles 95
3.9. In vitro cell culture 95
4.Results and Discussion 97
4.1. Characterization of TLH conjugate 97
4.2. Sol-gel transition behavior 102
4.3. Quantitative analysis of heparin activity 105
4.4. bFGF affinity and release profiles 108
4.5. In vitro cell culture 112
5.Conclusion 117
6.References 118
Chapter 4. A Novel Coating System of Heparin on a Metallic Substrate for Cardiovascular Application 121
1.Summary 122
2.Introduction 123
3.Materials and Method 127
3.1. Materials 127
3.2. Synthesis of DA-PEG-TA (PTD) 127
3.3. Synthesis of heparin-PEG-TA (HPT) 128
3.4. PTD and HPT grafting on the 316L SS substrate 129
3.5. Characterization of PTD-SS and HPT-SS 129
3.6. Heparin activities of the HPT-SS 130
3.7. In vitro protein adsorption and platelet adhesion assay 131
4.Results and Discussion 133
4.1. Synthesis of PTD and HPT 133
4.2. PTD grafting on the 316L SS 138
4.3. HPT immobilization on the PTD-SS 144
4.4. Effect of reaction time 152
4.5. Heparin activities of the HPT-SS 156
4.6. In vitro protein adsorption assay 159
4.7. In vitro platelet adhesion and activation assays 161
5.Conclusion166
6.References 167
Abstract in Korean 170
