뇌졸중동물모델에서 중간엽줄기세포의 치료효과 규명
Verification of Therapeutic Efficacy of Mesenchymal Stem Cells in Animal Stroke Model
초록/요약
Mesenchymal stem cells (MSCs) secrete bioactive factors that exert diverse responses in vivo. In PART I, it was explored mechanism how MSCs may lead to higher functional recovery in the animal stroke model. Bone marrow-derived MSCs were transplanted into the brain parenchyma 3 days after induction of stroke by occluding middle cerebral artery for 2 hours. Stoke induced proliferation of resident neural stem cells in subventricular zone. However, most of new born cells underwent cell death and had a limited impact on functional recovery after stroke. Transplantation of MSCs enhanced proliferation of endogenous neural stem cells while suppressing the cell death of newly generated cells. Thereby, newborn cells migrated toward ischemic territory and differentiated in ischemic boundaries into DCX+ neuroblasts at higher rates in animals with MSCs compared to PBS group. The present study indicates that therapeutic effects of MSCs is at least partly ascribed to dual functions of MSCs by enhancing endogenous neurogenesis and protecting newborn cells from deleterious environment. The results reinforce the prospects clinical application using MSCs in the treatment of neurological disorders. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been shown to ameliorate a variety of neurological dysfunctions. This effect is believed to be mediated by their paracrine functions, since these cells rarely differentiate into neuronal cells. It is of clinical interest whether neural induction of MSCs is beneficial for the replacement therapy of neurological diseases. In PART II, it was been reported that expression of Neurogenin1 (Ngn1), a proneural gene that directs neuronal differentiation of progenitor cells during development, is sufficient to convert the mesodermal cell fate of MSCs into a neuronal one. Importantly, transplantation of Ngn1-expressing MSCs in the animal stroke model dramatically improved motor functions compared to the parental MSCs. MSCs with Ngn1 populated the ischemic brain where they expressed mature neuronal markers including MAP2, NF200, and VGLUT2; and functionally connected to host neurons. MSCs with and without Ngn1 were indistinguishable in reducing the numbers of Iba1+, ED1+ inflammatory cells or TUNEL+ apoptotic cells or in increasing the numbers of proliferating Ki67+ cells. The data indicate that in addition to the intrinsic paracrine functions of MSCs, motor dysfunctions were remarkably improved by MSCs able to transdifferentiate into neuronal cells. Thus, neural induction of MSCs is advantageous for the treatment of neurological dysfunctions.
more초록/요약
중간엽줄기세포는 골수등의 장기에서 채취할 수 있으며, 같은 배엽성 세포인 중간엽성 세포로 분화할 수 있는 능력 외에도 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 이용하여 뇌졸중을 비롯한 여러 신경계질환에서 세포치료제로 이용될 수 있다. PART I 에서 중간엽줄기세포가 여러 생리활성 물질을 분비할 수 있는 능력을 가지고 있다는 사실에 입각하여 뇌졸중 동물모델에 적용하여 그 치료효과를 확인하였다. 뇌졸중 유도 3 일 후에 중간엽줄기세포를 대뇌주입방법으로 이식하고, subventricular zone 에 존재하고 있는 신경줄기세포의 증식능력을 bromodeoxyuridine 을 복강내 주입하여 확인해보았다. 대조군인 PBS 를 주입하였을 경우, 대부분의 세로 생성된 신경세포가 apoptotic cell death 로 사멸하여, 매우 제한된 정도의 치료효과를 갖고오는데 반해, 중간엽줄기세포를 이식하였을 경우, subventricular zone 에서 신경줄시세포의 분열이 촉진되는 한편, 새로 생성된 신경세포의 세포사멸이 억제되어, 따라서 ischemic territory 쪽으로 새로 생성된 신경모세포가 이동하여 신경세포로 분화하는 양이 증가한다는 것을 확인하였다. 결국, 뇌졸중 동물모델에 중간엽줄기세포를 이식하였을 때, 그 치료효과가 나타나는 것은 이식된 중간엽줄기세포에 의해 신경줄기세포의 분열 및 보호가 촉진되어 그 효과가 나타난다고 할 수 있다. 하지만, 중간엽줄기세포의 중요한 특징 중 한가지인 신경세포로의 분화능은 본 연구에서 확인할 수 없었다. 이것은 이식된 세포가 뇌졸중 동물모델에서 생존할 수 있는 생존율이 매우 떨어지고, 신경세포로의 분화능도 매우 떨어진다는 것을 의미한다. PART II 에서는 이러한 중간엽줄기세포의 제한된 치료효능을 극복하고자, 신경계에서 신경줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 Neurogenin1 을 중간엽줄기세포에 도입하여 뇌졸중 동물모델에서 그 치료효능을 살펴보았다. 중간엽줄기세포에 retrovirus 를 이용하여 Neurogenin1 을 도입하고, 그 치료효능을 확인해 본 결과, 중간엽줄기세포에 비해 그 치료효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 중간엽줄기세포가 뇌졸중 동물모델에서 세포의 생존률이 매우 떨어지고, 그 분화능도 astrocyte 계열로 대부분 분화하는 것에 반해, Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포의 경우, 생존률이 매우 뛰어나고, 그 분화능도 대부분, 신경세포로 분화하고, 또한 VGLUT2 양성인 glutamatergic 신경세포로 분화하는 것을 확인하였다. 또한 Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포의 경우 host 의 신경세포와 기능적으로 연결되어 있는 것을 확인함으로써 이 신경세포는 기능적으로 성숙한 신경세포임을 확인하였다. 또한 중간엽줄기세포가 가지고 있는 paracrine efffect 인 내재성 신경줄기세포의 분열 촉진, 세포사멸 억제, 염증반응 억제 등의 효과를 Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포에서도 확인함으로써, 이 세포는 그 모세포인 중간엽줄기세포가 갖고 있는 기본적인 특징은 모두 가지고 있으면서, Neurogenin1 에 의해 신경세포로의 분화능이 촉진됨으로써 뇌졸중 동물모델에서 그 치료효과가 중간엽줄기세포보다 더 뛰어남을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 기존의 중간엽줄기세포를 이용한 뇌졸중 치료에 있어서 신경세포로 분화가 유도된 중간엽줄기세포의 경우 더 높은 치료효과를 기대할 수 있다는 사실을 시사한다.
more목차
ABSTRACT = i
TABLE OF CONTENTS = iii
LIST OF FIGURES = vi
LIST OF TABLES = ix
I. INTRODUCTION = 1
II. MATERIALS AND METHODS = 4
1. Cell culture = 4
2. Induction of stroke and transplantation of MSCs = 4
3. Behavior tests = 7
4. Magnetic resonance imaging = 8
5. Immunohistochemical analysis and Quantification = 9
6. Quantification = 10
III. RESULTS = 12
IV. DISCUSSION = 22
PART II. Neural Induction with Neurogenin1 Increases the Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cells in the Ischemic Brain = 26
I. INTRODUCTION = 27
II. MATERIALS AND METHODS = 29
1. Ischemic animal model and cell transplantation = 29
2. Fluorescent immunohistochemistry = 32
3. Stereological quantification = 34
4. Neuronal tracing = 36
5. MRI and measurements of infarct volume = 36
6. Motor function evaluation = 37
7. Statistical analysis = 40
III. RESULTS = 41
IV. DISCUSSION = 70
REFERENCES = 76
국문요약 = 90
