돌연변이 알파시누클레인의 정제와 특성
Purification and Characterization of mutated Alpha-Synuclein
초록/요약
Synuclein is a 140 amino acid protein of 14.5 KDa that is encoded by a single gene consisting of seven exons borne by chromosome 4. All synucleins are highly enriched in the central nervous system of mammals. In the brain synucleins are present in various nuclei, but their presence in high concentrations in the neocortex, hippocampus, and substantia nigra, three brain zones reminiscent of those affected early in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, is of particular interest and likely underlies the participation of these proteins in neurodegenerative disorders. This study showed that purification of wild-type human alpha-synuclein and mutated synucleins behave as intermediates of amyloid, a cause of a synucleinopathies that include Parkinson’s disease, dementia with Lewy bodies. I found that both sited-directed mutated alpha-synuclein and, add cysteine mutated alpha-synuclein react upon disulfide interaction. This would add other experimental possibilities to form amyloid for characterizing synuclein and these devastating diseases.
more초록/요약
알파 시누클레인은 Chromosome 4q21.3-q22에 존재하며 140개의 아미노산으로 이루어져 있는 뇌에 존재하는 천연 단백질로서 특히 presynaptic terminal 담당하는 단백질이다. 알파 시누클레인은 정상적으로는 신경 세포단위의 시냅스를 경유하는 신호전달을 담당하지만 정상적인 기능을 잃어버리면 아밀로이드 섬유나 루이소체에서 추출되는 섬우의 형태를 가지게 된다. 이는 파킨슨씨병을 야기시킬 수 있는 병인의 중요한 구성성분임이 많은 연구를 통해 밝혀지고 있으며 그 시발점인 알파 시누클레인이 아밀로이드화되는 기작을 밝히는 연구가 중요성을 가지게 되는 이유이다. 본 연구는 파킨슨씨병의 원인물질로 예상되는 알파 시누클레인의 구조분석과 아밀로이드 형성의 중간체를 유도하는 돌연변이를 제작하여 그 특성을 비교 분석하고자 하였다. 본 연구는 우선 열 안정성을 가지는 알파 시누클레인을 고온에서 처리하고 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)를 사용하여 정제 후 SDS-PAGE(Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) 와 HPLC(High Pressure Liquid Chromatogrphy)상으로 확인하였다. 정제된 알파 시누클레인으로 구조 및 특성을 밝히기 위하여 형광측정, TEM(Transmission Electron Microscopy), CD(Circular Dichroism) 을 실시하여 연구를 진행하였다. 이에 이어서 site directed mutation 을 이용하여 알파 시누클레인 30번(Alanine), 46qjs번(Glutamic acid), 53번(Alanine)을 각각 Cysteine 으로 point mutation 시킨 세 가지의 돌연변이를 정제하고, N-terminal 에 Cysteine 을 추가한 것, C-terminal 에 Cysteine 을 추가한 것, N 과 C-terminal 에 추가한 세 가지의 mutant(3cys, 5cys, 3,5cys) 도 정제하여 그 특성을 연구하였다.
more목차
List of Figures = ⅰ
국문요약 = ⅱ
1. 서론 = 8
1.1. 연구배경 = 8
1.2. 알파 시누클레인 = 9
1.2.1. 역할과 기능 = 9
1.2.2. 변형 = 9
1.2.3. 돌연변이 = 10
1.2.4. 파킨슨씨병과의 관계 = 10
1.3. 연구 목적 = 11
2. 실험재료 및 방법 = 12
2.1. 실험재료 = 12
2.1.1. 알파 시누클레인 = 12
2.1.2. 균주 및 벡터 = 14
2.1.3. 배양 = 14
2.1.4. 시약 = 14
2.2. 실험방법 = 15
2.2.1. Transformation = 15
2.2.2. Site-directed mutagenesis = 16
2.2.3. Protein purification = 16
2.2.3.1. Anion Chromatography = 16
2.2.3.2. Cation Chromatography = 17
2.2.3.3. SEC (Size exclusion chromatography) = 17
2.2.4. Lowry-Folin = 17
2.3. 분석방법 = 18
2.3.1. PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) = 18
2.3.2. Fluorescence assay = 18
2.3.2.1. ANS (8-Anilino-1-Naphthalene Sulfonic acid) = 18
2.3.2.2. Intrinsic Fluorescence = 19
2.3.3. Western blot = 19
2.3.4. CD (Circular Dichroism) = 20
2.3.5. HPLC (High pressure liquid chromatography) = 20
2.3.6. MALDI-TOF MASS spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight) = 20
3. 결과 및 고찰 = 21
3.1. 알파 시누클레인의 정제 = 21
3.2. 알파 시누클레인의 특성 = 22
4. 결론 = 40
5. 참고문헌 = 41
Abstract = 45
