ALS 동물 모델에서의 운동신경세포사멸 기전 및 치료방법 연구
Mechanisms and Pharmacological Intervention of Motor Neuron Degeneration in an Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis
- 주제(키워드) ALS , G93A , Oxidative stress , Apoptosis , Fas , FADD , Caspase , Li+ , iron , inflammation , deferoxamine , 산화적 손상 , 신경세포고사 , 리튬 , 철 , TACE , TNF-α , neuroinflammation
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 곽병주
- 발행년도 2008
- 학위수여년월 2008. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Amyotrophic lateral sclerosis, one of the most common adult-onset neurodegenerative diseases leading to a rapidly progressive paralysis due to motor neurons death, has no known cure. Oxidative stress, apoptosis, and inflammation have been implicated in the pathogenesis of ALS. The present study is aimed to delineate causative roles and mechanisms of oxidative stress, apoptosis, and inflammation turning to a mouse model of ALS. In Part I, We tested the hypothesis that the Fas pathway and oxidative stress synergistically would produce spinal motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Levels of reactive oxygen species were increased in motor neurons from ALS mice compared to wild-type mice at 10 weeks of age, before symptom onset. The proapoptotic proteins Fas, FADD, caspase 8, and caspase 3 were also elevated. Oral administration of 2-hydroxy-5-(2,3,5,6-tetrafluoro-4-trifluoromethyl-benzylamino)-benzoic acid (Neu2000), a potent antioxidant, blocked the increase in reactive oxygen species but only slightly reduced activation of proapoptotic proteins. Administration of lithium carbonate (Li+), a mood stabilizer that prevents apoptosis, blocked the apoptosis machinery without preventing oxidative stress. Neu2000 or Li+ alone significantly enhanced survival time and motor function and together had an additive effect. These findings provide evidence that jointly targeting oxidative stress and Fas-mediated apoptosis can prevent neuronal loss and motor dysfunction in ALS. In Part II, We set out experiments to examine if iron would mediate free radical production in ALS mice. Iron accumulation, as determined by Perl’s staining, was observed selectively in ventral motor neurons from ALS mice even at 4 weeks of age, which was accompanied by subsequent free radical production. Administration of deferoxamine, a specific iron chelator, as well as Neu2000, a potent antioxidant, prevented production of free radicals and degeneration of the spinal motor neurons from ALS mice. Proliferation and activation of microglial cells were increased in the ventral horn of ALS mice at 16 weeks of age. The inflammatory response was also prevented by daily administration of deferoxamine as well as Neu2000. The present findings suggest that iron overload plays a central role in free radical production, neuronal death, and inflammation in ALS mice.
more초록/요약
일반적으로 루게릭병 이라고 알려져 있는 ALS는 중추신경내의 운동신경세포만을 선택적으로 사멸시키면서 근위축에 의한 근력 약화, 근육 말림, 운동 장애, 전신 마비에 이르게 되어, 결국 호흡근과 심장근의 마비로 사망하게 되는 질병이다. 운동신경세포 사멸에는 산화적 독성 (oxidative stress)와 세포고사 (apoptosis)가 관여되어 있으며, 신경면역반응 (neuroinflammation) 또한 질병을 악화시키는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 본 논문에서는 ALS 동물모델 (G93A mice)을 이용하여 산화독성과 Fas 단백질이 매개하는 세포고사 (apoptosis)가 운동신경세포사멸에 관여하는 유형과 철이 유도하는 산화적 독성에서부터 신경면역반응에 이르기까지의 연관성을 관찰한 후 각 기전에 대한 치료방법에 따른 효과를 확인하였다. 첫 번째 연구 주제에서는, 뇌졸중과 같은 신경계 질환들에서 산화적 손상과 Fas에 의한 세포고사 (apoptosis)가 신경세포 사멸 과정을 매개 하는 것으로 보고되어 있으므로 이 두 가지 요소가 ALS 동물 모델에서 운동신경 세포 사멸을 유도하는 기전을 공동상승(synergy) 시키는 이론에 대하여 탐색하였다. 산화적 손상 확인 실험으로 병변이 주로 나타나는 요수 조직에 Nitrotyrosine 항체를 이용하여 조직학면역기법을 이용하여 그 발현 정도를 ALS 병변을 보이는 동물 과 병변이 없는 형제 동물과 비교하여 확인하였다. 실험 결과, ALS 병변을 보이는 요수 조직의 운동신경 세포내에서 Nitrotyrosine의 발현정도가 병변이 없는 형제 동물에 비하여 어린 나이인 4 주령부터 유의적인 차이를 보이며 증가하고 있었고, 10주령이 되는 시기까지 3배 이상의 차이를 보이며 발현 정도가 강화되어 있었다. 이는 운동신경세포가 죽기 시작하는 8 주령 보다 빠른 시기에 산화적 손상이 확인되는 결과를 보였다. Fas 단백질이 매개하는 FADD, caspase-8, caspase-3 단백질들의 경로에 대하여 살펴본 결과 12 주령이 되는 ALS 동물모델에서 유의적인 차이가 가장 최대값을 보이며 증가하였다. 항산화제인 Neu2000 (2-hydroxy-5-(2,3,5,6-tetrafluoro-4- trifluoromethyl-benzylamino)-benzoic acid)을 ALS 동물 모델에 투여하였더니 완벽하게 산화적 손상을 차단하였다. 하지만, Fas 단백질이 매개하는 세포고사(apoptosis)는 약하게 차단하였다. 항우울증 약물로 알려져 있는 리튬(Li+)을 항세포고사약물(anti-apoptotic drug)로 ALS 동물 모델에 투여하였더니 산화적 손상은 줄이지 못하지만 Fas 단백질 매개 경로는 완벽하게 제어하는 결과를 보였다. Neu2000 또는 리튬 (Li+)을 ALS 동물모델에 각각 단독투여 하였더니 운동신경세포보호, 운동능력의 개선 및 생존능력 연장에 효과를 보였으며, 두 약물을 복합 투여 했을 때에 그 능력이 탁월하게 상승되는 결과를 얻었다. 따라서 산화적 손상 (oxidative stress) 와 Fas 단백질이 매개하는 세포고사(apoptosis)는 ALS 동물 모델에서 서로 다른 양상의 세포 사멸 형태를 보이며 이 두 경로를 타겟 으로 하여 약물을 복합투여를 하였을 때 운동신경세포 사멸을 보호하는 효과나 운동능력이 개선되는 효과가 배로 나타나는 새로운 약물의 칵테일 요법 (cocktail therapy)을 발견하였다. 두 번째 주제에서는, 자유 라디칼이 ALS 환자와 동물모델에서 운동신경세포사멸에 기여하는 능력이 잘 알려져 있는데 ALS 동물 모델에 생성되는 자유 라디칼이 철(iron)에 의해 매개 될 수 있는지에 대한 연구이며 이는 신경면역반응까지 관여하는지에 대한 연구이다. 철의 축적은 Perl’s staining에 의하여 확인하였으며, 철의 축적은 ALS 동물 요수의 운동신경세포에 선택적으로 4 주령부터 증가되어 있었고, 이는 ROS 생성을 수반하였다. 철의 제거약물인 DFO (deferoxamine) 는 항산화제인 Neu2000과 마찬가지로 ALS 동물에 발생 된 산화적 손상을 효과적으로 차단하는 결과는 물론 신경세포사멸을 제어하는 효과를 나타내었다. ALS 동물모델이 16 주령이 되었을 때 글리아 세포들의 발생과 활성화가 현저히 증가 되어 있으며, TACE 단백질의 활성화와 그로 인한 TNF-α 의 발생 정도가 요수 조직에 확산되어 있다. 이런 면역반응 또한 DFO와 Neu2000을 각각 투여하였을 때 보호되었다. 이런 결과들은 철의 축적이 ALS 질병의 진행되는 과정에서 나타나는 산화적 손상, 운동신경세포사멸 및 신경면역반응(neuroinflammation)에 주요한 역할을 할 것이라고 제안한다.
more목차
I. Introduction = 1
A. Overview = 1
B. Parallel pathway of oxidative stress and apoptosis = 1
1. Oxidative stress and apoptosis in ALS = 1
2. Two separate routes of the motor neuron degeneration in ALS = 2
C. The role of iron from oxidative stress to neuroinflammation = 4
1. Iron triggers oxidative stress and neuronal death = 4
2. Iron is implicated in neuroinflammation = 5
D. Purpose of study = 7
II. Materials and Methods = 8
III. Results = 14
A. Oxidative stress and Fas pathway involved distinctively in motor neuron degeneration in a mouse model of ALS = 14
1. Oxidative stress precedes motor neuron degeneration in G93A transgenic mice = 14
2. The Fas-mediated apoptosis signaling pathway is activated in G93A transgenic mice = 20
3. Neu2000 and lithium carbonate prevent oxidative stress and apoptosis in cultured cortical neurons and G93A transgenic mice = 26
4. Neu2000 and Li+ additively delay progression of motor function deficit in G93A transgenic mice = 35
5. Neu2000 and lithium have synergistic effects on mortality and motor neuron survival in G93A transgenic mice = 38
B. Iron initiates free radical production and neuronal death in a transgenic mouse model of ALS = 42
1. Iron is selectively accumulated in lumbar spinal ventral motor neurons of G93A transgenic mice causing motor neuron degeneration = 42
2. Deferoxamine (DFO) and Neu2000 prevent iron-mediated ROS production and motor neuron loss in G93A transgenic mice = 45
3. DFO or Neu2000 improve motor performance, onset of motor function deficit, and life expectancy in G93A transgenic mice = 50
C. The vicious cycle of iron and iron-mediated ROS production correlates with neuroinflammation leading to motor neuron death = 54
1. Activated glial cells have occurred in lumbar cord of G93A transgenic mice = 54
2. Deferoxamine (DFO) and Neu2000 attenuate activation of microglia and astrocyte in lumbar ventral horn of the G93A transgenic mice = 56
3. Proinflammatory cytokine and its regulator are elevated in G93A transgenic mice = 59
4. Iron and Iron-mediated ROS production are correlated with the elevated proinflammatory cytokine and its regulator in G93A transgenic mice = 63
IV. Discussion = 69
A. Concurrent administration of Neu2000 and lithium produces marked improvement of motor neuron survival, motor function, and mortality in a mouse model of ALS = 69
B. Iron mediates free radical production, inflammation, and neuronal death in a transgenic mouse model of ALS = 75
V. SUMMARY AND CONCLUSION = 80
REFERENCES = 83
―국문 요약― = 99
