연골 조직공학을 위한 피브린/하이알로난 혼합젤의 응용
Application of Fibrin/Hyaluronan Composite Gel for Cartilage Tissue Engineering
- 주제(키워드) fibrin , hyaluronic acid , chodrogenesis , cartilage regeneration , MSCs
- 주제(KDC) 570
- 주제(DDC) 660
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 민병현
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 영어
초록/요약
Introduction Tissue engineering is an emerging interdisciplinary field in biomedical engineering and aims at regenerating new biological tissue for replacing diseased or devastated tissues by using cells. Especially, tissue engineering is defined to include products or process that (1) well designed biomaterials, (2) generate cells or tissue, (3) provide growth factor and (4) various advanced technology include a mechanical stimulator. We carried out four experiments for find the optimal condition for cartilage tissue engineering. Chapter Ⅲ: This chapter introduced fibrin/hyaluronan (HA) composite with embedded chondrocytes and evaluated its feasibility as not only a cell carrier but a structural matrix. Fibrin/HA composite gel showed the possibility as a scaffold materials. We used the fibrin/HA composite gel for cartilage tissue engineering using chondrocytes. The scaffold and chondrocytes were showed not leaking from the defect and cartilage regenerated more rapidly in the fibrin/HA composite gel with chodrocytes than the group without them in animal defect experiment. Chapter Ⅳ: However, it had some defects to be solved for its feasibility as a cell delivery carrier, such as weak mechanical property and quick degradation time. To overcome these drawbacks, we tested the fibrinolysis inhibition factors (aprotinin, elastatinal, EACA). We proved the safety of inhibitors of the fibrinolytic system without hazardous effect on cell behavior and found out that elastatinal would be the most effective agent. Chapter Ⅴ: Even though these trials, the fibrin/HA gel showed lack of complete cartilage formation in the peripheral area, probably due to inefficient differentiation of cells or material degradation. Therefore, we developed coating method of the fibrin/HA composite with alginate layer coating. Coating method provided proper environment for cartilage formation on fibrin/HA composite gel with an inhibition of its degradation. Chapter Ⅵ: We also applied fibrin/HA composite gel for differentiation of MSCs in vitro. The importance of scaffold biomaterials has been emphasized, regarding in vitro culture of tissue-engineered cartilage in a three-dimensional (3D) environment. Fibrin/HA composite gel realize to good chondrogenesis of MSC without treatment of growth factors in this study. That is that fibrin/HA composite gel provided a favorable environment for differentiation of MSC to synthesize cartilage ECMs. Here we demonstrated the feasibility of a fibrin/HA composite hydrogel as a scaffold for chondrogenesis of MSCs. Conclusion Various modified materials (scaffold and growth factor) and methods could be provide improving results to enhance the material biocompatibility, degradation rate and control the mechanical properties. In conclusion, this thesis showed the possibility of fibrin/HA composite gel application as a cell delivery vehicle and chondrogenic inducted scaffold for cartilage tissue engineering.
more초록/요약
서론 ; 조직공학은 손상 받은 조직을 세포를 이용하여 새로운 조직으로 재생시키는것을 목적으로 하는 다학제간의 협동 학문이다. 이러한 조직공학의 성공을 위해서는 적합한 (1) 생체재료 (2) 세포 (3) 성장인자 (4) 기계적 자극을 포함하는 발전된 응용 기술등이 갖춰져서 조화를 이루어야 한다. 연골 조직공학의 성공을 위해필요한 요인들을 좀 더 발전적인 개발을 목적으로 이 논문의 4가지 연구들이 진행되었다. 제 3장에서는 선행 실험에서 연구되어진 피브린, 하이알로난 혼합 지지체를 이용한연골 세포 전달 지지체로서의 가능성과 조직 공학적 지지체로서의 응용을 연골 결손 동물과 지지체 배양을 이용하여 확인 하고자 하였다. 그 결과 혼합 지지체의 단독 처리보다는 세포를 함유시켜 처리한 실험군에서 우수한 효과를 보였다. 하지만이러한 좋은 효과를 보인 피브린, 하이알로난 혼합 지지체도 자연 유래 생체 재료의 단점인 쉽게 분해되는 단점을 극복하지 못하였다. 따라서 피브린 지지체의 분해억제 인자들을 (aprotinin, elastatinal, EACA) 혼합 지지체 첨가하여 그 효과를검증하고자 하였다. 이 실험에서는 기존에 상품화 되어있는 aprotinin 보다 새로운후보 물질인 elastatinal이 더 나은 분해 억제 효과를 보였다. (제 4장) 이와 같은노력에도 불구하고 눈에 띌만한 분해 억제 효과를 얻지 못하여 새로운 대안으로 피브린, 하이알로난 혼합 지지체를 다른 자연 유래 생체 재료인 알지네이트로 코팅하는 방법을 시도하였다. 그 결과 코팅으로 인해 혼합 지지체의 분해 억제에 띄어나효과를 보여 주었고, 연골화 분화에도 기존의 혼합 지지체의 효과를 유지 시키는결과를 얻었다. (제 5장) 제 6장에서는 앞선 연구에서 얻은 연골 세포 전달체 및 조직 공학적 지지체 응용연구를 토대로 중간엽 줄기 세포의 연골화 분화를 위한 지지체로서의 가능성을 확인 하는 연구를 진행하였다. 그 결과 이제까지 3차원 연골화 분화 모델로 주로 쓰인 펠렛 및 알지네이트 배양에 비해 배양 기간 중 안정성이 뛰어났고, 성장인자가첨가되어야 좋은 연골화 분화 효과를 보이는 다른 배양과는 달리 외부 성장인자의첨가 없이도 중간엽 줄기 세포의 연골화 분화를 효과적으로 생체외에서 유도 시킬수 있었다. 결론 ; 다양하게 제작되어진 재료와 방법들을 사용하여 생체 재료의 생체 적합성,분해서 기계적 적합성 등을 구현 할 수 있다. 이 논문에서는 연골 세포를 위한 피브린, 하이알로난 혼합 지지체의 세포 전달 지지체와 조직공학적 기법 응용을 위한생체 재료로서의 가능성을 검증하였고 또한, 줄기 세포의 연골화 분화의 응용 방안을 제시 하였다.
more목차
Background = 1
Hyaline Cartilage = 1
Anatomy = 1
Cell type = 1
Collagen = 2
Glycosaminoglycans = 2
Compression = 3
Tissue engineering = 3
Materials for cartilage tissue engineering = 5
Fibrin = 6
Hyaluronic acid (Hyaluronan) = 8
Alginate = 9
Cell source and culture method for cartilage tissue engineering = 11
Chondrocytes = 12
Mesenchymal stem cells = 13
Serum-free medium culture = 15
Hydrogel application for tissue engineering = 16
Growth factor for cartilage tissue engineering = 17
Transforming growth factor-β(TGF-β) = 18
Chapter Ⅰ. Introduction = 19
1.1. General introduction = 19
1.2. Motivation and aims = 22
Chapter Ⅱ. Materials and methods = 24
2.1. Ethical approvalS = 24
2.2. Preparation of cells = 24
2.2.1 . Chondrocytes - Rabbit = 24
2.2.2 . Chondrocytes - Goat = 25
2.2.3 . MSCs - Rabbit = 25
2.3. Preparation of scaffolds = 26
2.3.1. Fabrication of fibrin/hyaluronic acid = 26
2.3.2. Alginate coating on fibrin/hyaluronic acid (chapter Ⅴ) = 27
2.4. Operation of experimental animals (chapter Ⅲ) = 27
2.4.1. Nude mouse = 27
2.4.2. Rabbit, Goat - cartilage defect = 28
2.4.3. Defect evaluation of healing defects = 28
2.5. Histology = 29
2.6. Immunohistochemistry of type Ⅱ collagen = 29
2.7. Analysis of chemical components = 30
2.7.1. Collagen contents = 30
2.7.2. Glycosaminoglycan content = 30
2.7.3. Hydroxyproline content = 30
2.8. Media analysis (chapter Ⅴ) = 31
2.8.1. Glucose content = 31
2.8.2. Nitrite (NO₂^(-) ) content = 31
2.8.3. Zymography = 32
2.8.4. Protein amount measurement = 32
2.9. RT-PCR = 33
2.10. Volume measurement = 33
2.11. Mechanical strength analysis = 34
Chapter Ⅲ. Fibrin/HA composite gel with chondrocyte = 35
3.1. Gross examination of the retrieved specimens in nude mouse = 36
3.2. Histological evaluation of nude mouse implantant = 36
3.3. Biochemical assays of the retrieved specimens from nude mouse = 39
3.4. Rabbit study = 41
3.4.1. Macroscopic observations of cartilage defects = 41
3.4.2. Histological evaluation = 41
3.4.3. Scoring of the repair tissue = 42
3.5. Goat study = 46
3.5.1. Macroscopic observations of cartilage defects = 46
3.5.2. Histological and immune-histochemical evaluation = 46
Chapter Ⅳ. Fibrin/HA composite gel with FIFs = 49
4.1. Gross observation and volume measurement of fibrin/HA composites = 51
4.2. Histological evaluation of fibrin/HA composites = 53
4.3. Analysis of mechanical strength of fibrin/HA compositesS = 56
Chapter Ⅴ. Alginate coating on fibrin/HA composite gel = 58
5.1. Gross observation = 60
5.2. Histology and immunohistochemistry analysis = 62
5.3. Total GAGs and Hydroxyproline contents = 65
5.4. Media analysis = 67
5.4.1. Glucose concentration in culture media = 67
5.4.2. Measurment of nitrite (NO₂^(-)) concentration = 67
5.4.3. Size observation and protein releasing test for degradation rate = 67
5.4.4. Fibrinolytic zymography = 67
5.5. Analysis of mechanical strength = 70
Chapter Ⅵ. fibrin/HA composite gel with MSCs = 71
6.1. Viability of cells in Fibrin/HA composite gel and alginate layer = 72
6.2. Gross observation = 74
6.3. Analysis of mechanical strength = 76
6.4. Histological analysis = 78
6.5. Total GAGs and collagen contents = 80
6.6. RT-PCR analysis = 82
Chapter Ⅶ. Discussion = 84
Chapter Ⅷ. Summary and conclusion = 96
Korean summary (국문 요약) = 98
Acknowledgements = 100
References = 102
Publication list = 114
