새로운 유전자 재조합법을 이용한 대장균내에서의 사람 TIMP-2 유전자의 가용성 발현
Enhancement of the solubility of human TIMP-2 in E. coli using modified In-vitro mutagenesis
초록/요약
The second family member of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP-2) is 21KDa protein which inhibits matrix metalloproteinases 2 (MMP-2). Expression of mammalian protein from E. coli often forms inclusion bodies. The requirement for the formation of 6 disulfide bonds in TIMP-2 folding is likely to be incompatible with the reducing environment of E. coli. However, this incompatibility can be often overcome by introducing mutagenesis. In this reason, we attempted to express soluble TIMP-2 in E. Coli by applying modified staggered extension process (StEP), one of the in vitro PCR-based recombinant mutagenesis methods, and error-prone PCR by adding extra manganeses. C-terminally located CAT fusion protein to the mutated TIMP-2 protein enables us to identify the soluble forms from the insoluble by virtue of chloramphenicol resistance. According to this scheme, E. coli harboring the chloramphenicol resistant variant TIMP-2 were selected and some colonies exhibited enhanced, soluble expression of TIMP-2 compared to the wild type. Therefore, StEP technique has been successfully imployed to enhance the proper folding thereby increasing solubility of TIMP-2, and the CAT dependent screening may be a simple and effective method to differentiate the soluble proteins from the insoluble in E. coli.
more초록/요약
암세포의 침윤은 숙주세포의 기저막, 세포외 기질을 침투함으로써 일어난다. 전이과정에서 작용하는 단백질가수분해 효소인 Matrix Metalloproteinases (MMPs)가 깊이 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며, MMP의 가수분해 활성은 Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMPs)에 의해 억제된다. TIMP-2는 21KDa 크기로 대장균에서 다른 많은 포유류 단백질과 마찬가지로 봉입체형태로 발현된다. TIMP-2의 3차원 구조 형성은 6개의 disulfide bond의 형성을 필요로 하고, 일반적으로 대장균 환경은 적합하지 않다. 본 연구에서는 대장균에서 불가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 유전자 shuffling 기법의 한 가지 방법인 StEP (staggered extension process)를 변형하여 기존의 StEP보다 짧은 시간에 denaturation과 primer annealing을 가능하게 하고, 동시에 Mn^(2+) , dGTP를 이용한 무작위 돌연변이 기법(random mutagenesis)을 혼용하여 대장균에서 가용성을 가지는 TIMP-2 재조합체를 생성하였다. 무작위로 재조합된 TIMP-2 유전자 중에서 가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 선별하기 위해서 Chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-fusion assay를 사용하였다. CAT 유전자는 가용성으로 발현되는 재조합 TIMP-2 유전자에 fusion되어 선택적으로 발현함으로써 높은 chloramphenicol 환경에서 생존이 가능하게 한다. 이러한 in vitro mutagenesis 기법과 CAT-fusion assay 방법으로 높은 재조합 빈도를 가진 대장균 가용성 TIMP-2 재조합체를 얻을 수 있었다. 본 연구에서 사용된 간편하고 새로운 in vitro recombination 기법과 CAT을 이용한 스크리닝기법은 다른 많은 대장균 내 불가용성 단백질의 발현에도 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
more목차
INTRODUCTION = 5
Materials and Methods = 9
PCR amplification and subcloning of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and human tissue inhibitors of metalloproteinase (hTIMP)-2 cDNA = 9
Random mutagenesis and Staggered extension process (StEP) of in vitro recombination = 10
Mutagenesis Fidelity Assay = 12
Screening and induction of TIMP-2 expression = 12
Analytical SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting = 13
Sequence analysis and 3-D modeling = 14
RESULTS = 16
In vitro recombination of human TIMP-2 genes by random mutagenesis and modified StEP = 16
Mutagenesis fidelity assay = 17
Selection of the soluble recombined TIMP-2 at high chloramphenicol concentration = 18
Expression of soluble recombined TIMP-2 / CAT fusion proteins = 19
Sequence analysis and three-dimensional structures of recombinant TIMP-2s = 20
DISCUSSION = 34
REFERENCES = 36
국문 요약 = 43
