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P2 Receptor Modulation of IL-10 Expression and Its Effects on the Production of Reactive Oxygen species in Brain Ischemia

뇌졸중에서 P2 퓨린 수용체에 의한 IL-10 발현조절 및 활산소종 생산에 대한 조절기전 연구

초록/요약

Recently, exogenous ATP has been introducted as a potential mediator of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and TNF-α production in rat microglia via P2 purinergic receptors. In addition, we showed that ATP evokes the expression of IL-10, an important anti-inflammatory modulator in the CNS, in rat microglia via P2 purinergic receptors. Therefore, we hypothesized that extracellular ATP, mediating microglial IL-10 expression, could protect ischemic brain injury by a negative feedback inhibition to limit the production of proinflammatory cytokines and reactive oxygen species (ROS). In the present study, we investigated that the expression patterns of IL-10 and P2 receptors were similarly increased in oxygen?glucose deprivation (OGD)-stimulated microglia, suggesting that both P2X7 and P2Y1 receptors are involved in extracellular ATP-evoked IL-10 release from OGD-stimulated microglia. H₂O₂ assay showed that ROS release from OGD-stimulated microglia was blocked by P2X7 specific antagonist such as o-ATP, whereas it was increased by P2Y1 specific antagonist such as MRS2179. Moreover, MRS2179 pre-treatment augmented OGD-stimulated neuronal cell death by blocking the IL-10 release from microglia. These results suggest that P2X7 receptor is the primary receptor stimulated by ATP to generate ROS in brain ischemia, and ischemic brain injury is regulated by IL-10 released from microglia through P2X7 and /or P2Y1 receptors.

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초록/요약

중추신경계에서 ATP는 신경전달물질로 알려져 왔다. 또한 최근 연구에 따르면 ATP는 P2 퓨린 수용체의 의해서 마이크로글리아에서 iNOS와 TNF-α의 발현을 조절한다고 제기되었다. 뿐만 아니라 우리는 항 염증 조절인자로 알려진 IL-10이 활성화된 마이크로글리아에서 발현되는 P2 퓨린 수용체를 통해 생성된다는 것을 확인하였다. 이에 본 연구에서는 P2 퓨린 수용체를 통해 생성되는 IL-10이 활성산소를 억제시켜 뇌졸중을 막아주는 작용에 대해서 연구하였다. 뇌졸중의 in vitro 모델인 신경세포-아스트로사이트-마이크로글리아 세포배양을 oxygen-glucose deprivation (OGD) 상태에서, 마이크로글리아 세포에서 IL-10, P2 퓨린 수용체, 활산소종의 발현을 확인을 하였다. 더 나아가 IL-10와 활성산소가 어떤 기작에 의해서 생성이 되는지를 확인하기 위해서 P2X7 수용체에 특이 antagonist인 o-ATP 및 P2Y1 의 수용체 측이 antagonist인 MRS2179를 처리하여 확인한 결과, IL-10의 생성에 P2X7, P2Y1 수용체가 모두 관여하는 반면 활산소종의 생성에는 P2X7 수용체만이 관여하는 것을 확인하였다. IL-10이 활산소종의 생성을 억제하는 것을 확인하기 위해서 anti-IL-10을 처리하여 확인한 결과, anti-IL-10 처리시 활산소종의 생성이 증가되는 것을 확인하였다. 더욱이, P2Y1 수용체의 특이 antagonist인 MRS2179에 의해 IL-10의 분비가 억제되어 P2X7에서 분비되는 활산소종을 억제하지 못하여 신경세포사멸이 증가되는 것을 확인하였다. 이로써 본 연구를 통하여 뇌졸중 상태에서 활성화된 마이크로글리아에서 발현된 P2X7 및 P2Y1 수용체에 의해 생성된 IL-10이 활성산소의 생성을 억제함으로써 뇌졸중에서 일어나는 신경세포사멸을 줄일 수 있다는 것을 규명하였다.

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목차

TABLE OF CONTENTS
APPROVAL PAGE = ⅰ
ACKNOWLEDGEMENT = ⅱ
ABSTRACT = ⅲ
TABLE OF CONTENTS = ⅴ
LIST OF FIGURES = ⅶ
LIST OF ABBREVIATIONS = ⅷ
INTRODUCTION = 1
MATERIALS AND METHODS = 4
1. Cortical neuron culture. = 4
2. Microglia and Astrocyte culture = 4
3. Neuron-microlgia-astrocyte co-culture = 5
4. Exposure of rat cortical culture to OGD = 5
5. Assessment of neuronal injury = 6
6. ATP efflux measurement = 6
7. Reverse transcription ― PCR (RT-PCR) analysis = 7
8. Determination of IL-10 release = 8
9. Immunocytochemistry = 8
10. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated fluorescein-dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay = 9
11. Detection of ROS = 10
12. Focal cerebral ischemia = 11
13. Tissue preparation = 11
14. Statistical analysis = 12
RESULTS = 13
1. Neuronal cell death and ATP release by OGD stimulation = 13
2. IL-10 expression and ROS production in OGD-stimulated micrglia = 14
3. P2 purinergic receptors expression on microglia in OGD-stimulated microglia = 14
4. IL-10 and ROS expression via P2Y or P2X7 receptors = 15
5. Effects of extracellular ATP on IL-10 and P2 purinergic receptor expression in OGD-stimulated microglia = 16
6. IL-10 protects cortical neurons against OGD-induced neuronal cell death = 17
7. Neuronal cell death after ischemia = 17
8. Expression of the IL-10 and P2 purinergic receptors on microglia after ischemia = 18
DISCUSSION = 19
REFERENCES = 24
국문요약 = 32

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