Regulation of Human Tyrosine Hydroxylase Gene Expression in Neuron Cell Type-Specific Manner by NRSF
- 주제(키워드) tyrosine hydroxylase , dopaminergic neuron , NRSF , neural stem cell
- 발행기관 아주대학교 대학원
- 지도교수 Lee, Myung Ae
- 발행년도 2005
- 학위수여년월 2005. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
Tyrosine hydroxylase (TH) is the first and rate-limiting enzyme in biosynthesis of catecholamines. TH expression is restricted to dopaminergic (DA) neurons of substantia nigra, ventral tegmental area, and the noradrenergic neurons in brain. In an effort to reveal transcriptional determinants of this tissue specificity, we recognized 3 putative neuron-restrictive silencer elements (NRSEs ; NRSE-R, NRSE-I and NRSE-II) known to bind transcriptional repressor zinc finger protein NRSF. Neuron-restrictive silencer factor (NRSF) functions as a transcriptional repressor of multiple neuron-specific genes in non-neuronal cells and tissues during neuronal development and in adulthood. To investigate if repression of TH gene in neural stem cell is mediated by NRSF, we performed western blotting of NRSF expression in neural stem cell and neuron like cells. NRSF proteins are expressed in human neural stem cells, but not in neuron-like cells. To determine NRSF-binding activity to NRSE region present in human TH promoter, we performed tansfection using mutated NRSEs constructs and mobility shift assay. The introduction of mutated NRSE-II construct abolished the repression activity driven by NRSF in human neural stem cells. However, in mobility shift assay, NRSF-binding complex bands were observed in all of three NRSEs probes of human TH promoter and these complexes were supershifted in the presence of anti-NRSF antibody. These results indicated that NRSF might recruit co-repressors effectively only in the NRSE-II motif of 5' flanking region of human TH promoter. And, the NRSF mediated repression of TH could be abolished by treatment of trichostatin A, indicating that histone deacetylase activity is required to allow NRSF repression. Taken together, these data suggests that NRSF plays a critical role in the control of neuron cell type-specific expression of human TH gene.
more초록/요약
Tyrosine hydroxylase (TH)는 카테콜아민 생합성 과정에서 첫 번째 속도 조절 효소이다. TH의 발현은 뇌의 흑질 (substantia nigra), 복측피개 (ventral tegmental area), 노르아드레날린성 신경세포 (noradrenergic neuron)에 있는 도파민 신경세포들에서만 국한되어 나타난다. 본 논문에서는 사람 TH 유전자의 신경세포-특이적 발현 조절의 기작을 밝히고자 하였다. 먼저, 사람 TH 유전자의 promoter에서 신경세포 특이적 전사 저해를 일으키는 DNA 부위 (neuron restrictive silencer element ; NRSE)로 추정되는 세 개의 부위를 동정하고 이를 각각 NRSE-R, NRSE-I, NRSE-II라 명명하였다. 이 부위에는 신경세포에서 전사 저해 작용을 하는 zinc finger 단백질인 NRSF가 결합하는 것으로 알려져 있다. 신경세포 특이적 전사 저해단백질 (neuron restrictive silencer factor; NRSF)은 신경 발달과정과 성체에서 비신경세포 및 조직에서의 여러 가지 신경 세포 특이적 유전자들의 전사 저해제로 작용한다. 사람 TH promoter 에 존재하는 NRSE 부위에서 NRSF의 결합 활성도를 알아보기 위해, 염기서열을 변이시킨 NRSE constructs의 promoter 활성도 측정과 EMSA 실험을 수행해보았다. 변이된 NRSE-II 유전자를 사람 신경줄기세포에 도입한 경우 NRSF에 의한 전사억제가 파기되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 EMSA 실험에서, 사람 TH promoter에 존재하는 세 개의 NRSEs 부위들에서 모두 단백질 결합 복합체가 형성되는 것을 볼 수 있었고, 이들 모두 항-NRSF 항체에 의해 supershift됨을 확인했다. 이러한 결과는 사람 신경줄기세포 내에서, NRSE-II 부위에서만 특이적으로 NRSF 와cofactor들간의 결합이 일어나서 효과적인NRSF 매개의 전사억제가 일어남을 암시하고 있다. 또한 NRSF를 매개로 한 TH 유전자의 전사 억제는 trichostatin A의 처리에 의해 풀리는 것으로 보아, NRSF에 의한 전사억제에 histone deacetylase 활성이 필수적 것을 알 수 있었다. 이로써, 사람 TH 유전자의 조직 특이적 발현 조절에 있어서 NRSF의 역할이 핵심적임을 알 수 있다.
more목차
TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT = i
TABLE OF CONTENTS = ⅱ
LIST OF FIGURES = ⅲ
Ⅰ. INTRODUCTION = 1
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 3
1. Cell culture = 3
2. Plasmid constructs and mutagenesis = 3
3. Transfection and luciferase assay = 4
4. Western blot analysis = 4
5. RNA preparation and RT-PCR = 5
6. Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA) = 6
7. Chromatin immunoprecipitation assay = 7
Ⅲ. RESULTS = 8
1. Identification of putative NRSEs motifs in the 5'-regulating region of the T =H gene 8
2. Cell-specific expression pattern of hTH promoter constructs = = 8
3. Cell type-specific expression of NRSF mRNA and proteins = 9
4. Transcriptional activation of the hTH promoter including mutant NRSEs = 10
5. Sequence-specific binding of NRSF to putative NRSE motifs in hTH promoter = 11
6. De-repression of hTH promoter deletion mutants by treatment of TSA or introduction of dominant negative NRSF = 13
Ⅳ. DISCUSSION = 15
Ⅴ. REFERENCES = 33
국문요약 = 38
