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Discovery of novel small molecular NLRP3 inhibitor for neuroinflammatory disease

  • 최홍준 (Hongjoon Choi, 아주대학교 일반대학원)

초록/요약

The NLRP3 inflammasome is a cytosolic protein complex involved in innate immune responses through the maturation of IL-1β and IL-18. Dysregulated activation of NLRP3 has been linked to a number of neuroinflammatory and neurodegenerative disorders, including multiple sclerosis （MS）, experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE）, and Alzheimer’s disease （AD）. Although NLRP3 is considered a promising therapeutic target, treatment options directly targeting this pathway remain limited. To search for new NLRP3 inhibitors, we carried out a structure-based virtual screening campaign using the ATP-binding region of NLRP3. From the compounds identified through screening, NIM5 and NIM22 were selected as initial hit compounds and used for further optimization. Structural modification of NIM5 generated a series of analogs with improved activity. The NIM5 series inhibited NLRP3 inflammasome activation with little effect on TLR4 signaling, inflammasome priming, or activation of the NLRC4 and AIM2 inflammasomes. In THP-1 macrophages, these compounds reduced IL-1β release and pyroptotic cell death associated with NLRP3 activation, with IC50 values ranging from 0.75 to 9.82 μM. Reduced levels of cleaved IL-1β, cleaved caspase-1, and cleaved GSDMD were observed after treatment, whereas expression of NLRP3 and pro-IL-1β was largely unchanged. The compounds also suppressed NLRP3 ATPase activity, suggesting direct effects on NLRP3 function. The activity of the NIM5 series was further evaluated in mouse models of neuroinflammatory and neurodegenerative disease. In EAE mice, oral treatment reduced clinical severity, improved motor performance, and decreased inflammatory cell infiltration. Lower expression of CD3ε, CD68, and F4/80 was observed in spinal cord and brain tissues. Among the analogs examined, NIM5e showed favorable i Abstract blood–brain barrier permeability and produced strong therapeutic effects both alone and in combination with dimethyl fumarate （DMF）. In an Aβ-induced AD model, treatment with NIM5 series reduced amyloid-β accumulation, microglial activation, and tau phosphorylation. NIM5 alone had limited effects in behavioral testing, whereas NIM5a improved spontaneous alternation performance in the Y-maze test, suggesting a protective effect against Aβ-induced cognitive impairment. Overall, the results indicate that the NIM5 scaffold represents a structurally distinct class of NLRP3 inhibitors with brain-penetrant properties. The findings support further investigation of NIM5 series as potential therapeutic candidates for NLRP3associated neurological disorders.

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초록/요약

NLRP3 인플라마좀은 IL-1β와 IL-18의 성숙 및 분비를 조절하는 세포질 내 단백질 복합체로서 선천면역 반응에 중요한 역할을 한다. NLRP3의 비정상적인 활성화는 다발성경화증（multiple sclerosis, MS）, 실험적 자가면역뇌척수염（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）, 알츠하이머병（Alzheimer’s disease, AD） 등 다양한 신경염증성 및 신경퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 이러한 질환의 치료를 위해 임상적으로 활용 가능한 NLRP3 표적 저해제는 제한적이다. 본 연구에서는 NLRP3의 ATP 결합 부위를 표적으로 한 구조 기반 가상 스크리닝을 수행하여 신규 NLRP3 저해제를 발굴하고자 하였다. 스크리닝을 통해 확보한 후보 물질 중 NIM5와 NIM22를 초기 hit 화합물로 선정하였으며, 이를 기반으로 구조 최적화를 진행하였다. 그 결과 NIM5를 모체 화합물로 하는 다양한 유도체를 확보할 수 있었다. NIM5 계열 화합물은 TLR4 신호전달, 인플라마좀 priming 과정, 그리고 NLRC4 및 AIM2 인플라마좀 활성에는 큰 영향을 주지 않으면서 NLRP3 인플라마좀 활성화를 선택적으로 억제하였다. THP-1 대식세포에서 이들 화합물은 NLRP3 의존적 IL-1β 분비와 pyroptosis를 효과적으로 감소시켰으며, IC50 값은 0.75~9.82 μM 범위로 확인되었다. 또한 cleaved IL-1β, cleaved caspase-1 및 cleaved GSDMD의 발현이 감소하였으나 NLRP3 및 pro-IL-1β의 발현에는 큰 변화가 나타나지 않았다. 아울러 NLRP3 ATPase 활성을 억제함으로써 NLRP3 기능을 직접적으로 조절할 가능성을 확인하였다. NIM5 계열의 생체 내 효능은 신경염증성 및 신경퇴행성 질환 동물모델에서 평가하였다. EAE 모델에서 경구 투여는 임상 점수를 개선하고 운동 기능 저하를 완화하였으며, 염증세포 침윤을 감소시켰다. 또한 척수와 뇌 조직에서 CD3ε, CD68 및 F4/80의 발현이 감소하는 경향을 보였다. 시험된 유도체 가운데 NIM5e는 우수한 혈액뇌 장벽 투과성을 나타냈으며, 단독 투여뿐 아니라 dimethyl fumarate（DMF）와의 병용 투여에서도 우수한 치료 효과를 보였다. Aβ 유도 알츠하이머병 모델에서도 NIM5 계열 화합물은 Amyloid-β 축적, 미세아교세포 활성화 및 tau 인산화를 감소시켰다. NIM5 단독 투여군에서는 행동학적 개선 효과가 제한적이었으나, NIM5a는 Y-maze 시험에서 자발적 교대 행동（spontaneous alternation）을 유의하게 증가시켜 Aβ로 유도된 인지기능 저하를 완화하는 효과를 나타냈다. 종합하면, NIM5 골격은 우수한 뇌 투과성을 갖는 새로운 NLRP3 저해제 계열로서 신경염증성 및 신경퇴행성 질환 치료를 위한 잠재력을 보유하고 있음을 확인하였다. 본 연구 결과는 NIM5 계열 화합물이 NLRP3 관련 신경질환 치료제 개발을 위한 유망한 후보물질이 될 수 있음을 시사한다.

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목차

CHAPTER 1: Introduction 1
1.1. Introduction 2
1.2. Signaling pathway of NLRP3 inflammasome 3
1.3. Structural organization of NLRP3 inflammasome 5
1.4. Role of NLRP3 inflammasome in neuroinflammatory diseases 7
CHAPTER 2: Materials and methods 9
2.1. Virtual screening procedure 10
2.2. Molecular fingerprint-based structural similarity analysis 11
2.3. Protein structure preparation 12
2.4. Structure-based virtual screening 12
2.5. Lead optimization 13
2.6. MD simulations 13
2.7. Cell culture 14
2.8. TLR4 and inflammasome activation 15
2.9. Cell viability assay 15
2.10. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LDH assay 16
2.11. Protein sample preparation and western blot analysis 16
2.12. ATPase assay 17
2.13. SPR assay 17
2.14. Parallel artificial membrane permeability (PAMPA)–BBB assay 18
2.15. EAE in a murine model 19
2.16. AD in a murine model 20
2.17. Behavior analysis 20
2.18. Histology and IHC assay 21
2.19. Statistical analysis 22
CHAPTER 3: Results 23
3.1. Identification of novel NLRP3 inhibitors by structure-based virtual screening 24
3.2. Structure-activity relationship studies and optimization of NIM5 analogs 26
3.3. NIM5 series inhibit canonical and non-canonical NLRP3 activation and selectively suppress ATP hydrolysis without affecting other inflammasomes or TLR signaling 38
3.4. Therapeutic effects of the NIM5 series in an EAE mouse model 41
3.5. Effects of NIM5 series on cognitive function and AD pathology 44
3.6. Characterization of NIM5 series binding to NLRP3 by SPR and molecular simulation 47
3.7. Structural dynamics and binding energy analysis of NLRP3 complexed with NIM 5 series 50
CHAPTER 4: Discussion 55
4.1. Discussion 56
4.2. Conclusion 58
CHAPTER 5: References 60
CHAPTER 6: 초록 69

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