인지질 산화 부산물에 의해 매개되는 Ferroptotic 세포사멸 과정에서의 Gasdermin E 활성화 기전
- 주제(키워드) ferroptosis , Gasdermin E , 4-Hydroxynonenal , 시스테인 변형 , EVs 분비
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 최용준
- 발행년도 2026
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000036000
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
인지질 산화 부산물에 의해 매개되는 Ferroptotic 세포사멸 과정에서의 Gasdermin E 활성화 기전 Ferroptosis 는 철(iron) 의존적 지질 과산화(lipid peroxidation)에 의해 유도되는 조절된 세포사(regulated cell death)의 한 형태로, apoptosis 나 necrosis 와 구별되는 특징을 가진다. gasdermin E (GSDME)는 apoptosis 동안 caspase-3 에 의해 절단되어 활성화되는 것으로 잘 알려져 있으나, ferroptosis 맥락에서 GSDME 가 어떤 방식으로 활성화되어 포어(pore) 형성에 관여하는지는 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 ferroptosis 과정에서 축적되는 대표적인 지질 과산화 부산물 4-hydroxynonenal (4-HNE)이 GSDME 의 시스테인 잔기를 표적하여 caspase 비의존적인 방식으로 GSDME 활성화와 포어 형성을 유도하는지 여부를 연구하였다. Extracellular vesicle (EVs)는 세포 상태와 세포사 유형에 따라 분비 양과 탑재된 cargo 구성이 크게 변화하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구는 ferroptosis 조건에서 4-HNE 에 의해 GSDME 가 활성화될 때 세포막 포어 형성과 더불어 EVs 분비가 어떻게 변화하는지를 함께 평가하였다. HEK293T 세포에서 ferroptosis 유도제(RSL3)를 처리한 결과, caspase-3 억제 조건에서도 GSDME 의 고분자화(oligomerization)와 EVs 분비가 증가하였다. 반면 GSDME 의 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한 C45A, C180A 및 C45A/C180A 이중 변이체에서는 GSDME 고분자화, 세포막 파열, 그리고 EVs 분비가 현저히 감소하였다. 이는 4-HNE 가 이러한 시스테인 잔기에 공유결합하여 GSDME 활성화와 포어 형성에 기여함을 시사한다. 본 연구는 4-HNE 매개 시스테인 변형을 통한 GSDME 의 새로운 활성화 기전을 제시하고, ferroptosis 동안 일어나는 포어 형성이 EVs 생합성 및 분비를 재구성하는 경로를 보여준다. 이러한 결과는 지질 과산화에 의해 유도되는 포어 형성이 EVs 분비를 조절하는 새로운 축을 제공함으로써, ferroptosis 의 병리학적 의미와 EVs 기반 신호 조절에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 핵심어: ferroptosis, Gasdermin E, 4-Hydroxynonenal, 시스테인 변형, EVs 분비
more목차
I. 서론 1
II. 재료 및 방법 5
A. 세포 배양 및 처리(Cell culture and Treatments) 5
B. 플라스미드 제작 및 부위특이적 돌연변이(Plasmid Construction and Site-directed Mutagenesis) 5
C. 일시적 형질전환 및 안정발현 세포주 확립(Transient Transfection, and Stable Cell Line Generation) 6
D. 세포 용해(cell lysates)및 Western Blot 분석 7
E. 면역침강(Immune Precipitation, IP) 및 Western Blot 분석 8
F. EVs 의 분리, 분별 원심분리(Differential centrifugation) 8
G. 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA) 9
H. 세포막 투과성 분석(Propidium Iodide assay) 9
I. LDH 방출 기반 세포막 파열 평가(LDH Release Assay) 10
J. Dimethyl pimelimidate(DMP) 기반 교차결합 반응 Crosslinking) 10
K. T-Coffee 기반 서열 정렬을 통한 GSDME 시스테인 보존성 및 Gasdermin 패밀리 비교 11
L. AlphaFold 기반 GSDME full-length 구조 예측 및 후보 시스테인 위치 분석 11
M. AlphaFold 기반 GSDME full-length 구조 예측 및 후보 시스테인 위치 분석 11
N. HEK293T 현탁 배양 기반 재조합 GSDME-6×His 발현 및 정제 12
O. 통계적 분석(Statistical Analyses) 13
III. 결과 14
A. Ferroptosis 조건에서 HEK293T 세포의 EVs 분비 및 세포막 손상 특성 14
B. Ferroptosis 유래 EVs 의 특성 분석 및 EVs 마커 검증 18
C. Ferroptosis 에서 Gasdermin 패밀리가 유도하는 세포막 파열과 EVs 방출 20
D. Ferroptosis 에서 caspase-3 비의존적 GSDME 고분자 밴드 형성 22
E. Ferroptosis 동안 GSDME 의 막 연관 구획 재분포와 LMF 에서의 고분자 형태 검출 24
F. Ferroptosis 동안 GSDME-FLAG 및 GSDME-His 의 올리고머 형성 27
G. Palmitoylation 억제 조건에서 GSDME 매개 Ferroptosis 의 변화 분석 29
H. 여러 종 및 Gasdermin 패밀리 서열 정렬 기반 4-HNE 반응 cysteine 후보 선별 31
I. DMP 교차결합을 통한 GSDME IP 분획의 4-HNE 신호 변화 34
J. GSDME 시스테인 변이체에 따른 RSL3 유도 세포막 파열 및 EVs 방출 변화 평가 36
K. AlphaFold 기반 GSDME 구조 분석을 통한 후보 잔기 제시 38
L. 시스테인 변이에 의한 GSDME 활성 저하와 ferroptosis 억제 . 40
M. Ferroptosis 동안 막 연관 GSDME 올리고머화와 Cys45/Cys180 의 기여 평가 43
N. 정제 full-length GSDME 에서 4-HNE 결합의 농도 의존성과 C45A-C180A 변이의 영향 47
IV. 고찰 50
V. 참고문헌 55
Abstract 58
