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염증성 장질환 모델 마우스에서 장내리포터 세균의 전사체 변화 분석

  • 김정탁 (아주대학교 일반대학원)

초록/요약

염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease)은 소장 및 대장에서 염증을 일으키는 원인 불명 의 만성적인 염증성 장 질환으로, 대표적으로 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론병 (Crohn’s disease)이 있다. 궤양성 대장염은 결장의 점막층에 국한된 병변을 특징으로 하는 반 면, 크론병은 장벽의 모든 층을 침범하여 장 천공을 초래할 수 있다. 현재 염증성 장질환의 진 단은 주로 내시경을 통한 장 생검에 의존하므로 비침습적이며 쉽게 접근할 수 있는 진단 방법 의 필요성이 있다. 최근 개발된 Record-seq 방법은 clustered regularly interspaced short palindromic repeats 시스템의 한 유형을 활용하여 대장균의 전사체 변화를 분석할 수 있는 방 법이다. 이 방법은 무균마우스를 이용한 장 염증 모델에서 염증을 모니터링할 수 있다고 보고 되어 있으나 장내미생물총이 형성된 경우 현실적인 활용 가능성에 대한 명확한 결론을 내리 기는 어렵다. 특히 장내미생물총이 염증성 대장염에 미치는 영향을 고려할 때, 장내 미생물총 이 형성된 마우스에서 리포터 세균의 전사체 변화가 장내 염증의 유무를 모니터링 하는데 활 용될 수 있는지 분석하는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 Record-seq을 활용한 장내 미생물총 이 존재하는 염증성 장 질환 마우스 모델 두가지에서 리포터대장균의 장내 유전자 발현 변화 를 조사했다. 그리고 Lactobacillus crispatus 의 경구 투여로 장내 미생물총의 변화를 유도하였 을 때, 대장균 발현에 미치는 영향을 규명하고자 했다. Dextran Sodium Sulfate (DSS) 또는 2,4- dinitrobenzenesulfonic acid를 사용한 대장염 모델과 대조군간 차등발현 유전자(DEG)가 관찰되 었으나, 두 모델에서 발견된 DEG에서 공통적인 유전자가 매우 제한적이었다. 또한 DSS를 사 용한 장염모델에서 장염증 정도와 DEG 간 상관성이 관찰되지 않았다. 한편 L. crispatus를 경 구 투여한 마우스에서 DSS로 장염을 유도한 군과 L. crispatus를 단독 투여한 대조군 간 장염증 의 유무 차이에도 불구하고 리포터 대장균의 전사체의 차이가 없었다. 이러한 결과는 리포터 대장균의 전사 변화는 숙주의 염증 반응뿐 만 아니라 장내 미생물총의 변화에 의해 크게 영향 을 받는다는 것을 시사한다. 이는 Record-seq을 활용한 전사체 분석이 장내 환경 변화를 민감 하게 반영할 수 있으므로 장내 환경 변화 모니터링에 유용하지만, 장내 미생물총의 변화가 장 내 염증 모니터링에 영향을 미치므로 비침습적 진단 도구로서 활용되기 위해 극복해야 할 문 제점이 있음을 제시한다. 핵심어: 염증성 장 질환, 전사체 녹화, 궤양성 대장염, 크론병, 크리스퍼 시스템

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목차

I. 서론 1
A. 염증성 장 질환 1
a. 궤양성 대장염과 크론병의 병태생리적 특징 및 진단적 과제 2
b. 장내 미생물총과 염증성 장 질환의 연관성 3
c. 염증성 장 질환 마우스 모델 3
B. 염증성 장질환 진단 4
a. 내시경 검사 4
b. MRI 5
c. 칼프로텍틴 검사 5
C. 전사체 녹화법(Record-seq) 6
a. CRISPR system 6
b. Record-seq의 원리와 확립 6
c. SENECA 6
D. 연구 목적 7
II. 재료 및 방법 10
A. 마우스 10
B. 대장염 유도 10
C. 질병 활성도 DAI 평가 10
D. 조직학적 분석 11
E. 세균 균주 및 배양 12
a. 균주 12
b. GFP 발현 대장균 경구 투여 12
c. L. crispatus 의 경구투여 12
F. Record-seq 12
a. 리포터 대장균의 배양과 경구투여 12
b. 플라스미드 DNA의 분리 13
c. SENECA 14
d. Next generation sequencing(NGS) 15
e. 스페이서 라이브러리 염기서열 정보를 이용한 전사체 분석 16
G. 통계 17
III. 결과 18
A. 염증성 장 질환 모델 마우스과 리포터 대장균의 전사체 분석 시점 결정 18
a. DSS를 사용한 대장염 모델 마우스 확립 18
b. DNBS를 사용한 모델 마우스 확립 22
B. L. crispatus 경구 투여에 따른 마우스의 장 염증 변화 24
C. 리포터 대장균의 경구 투여 후 회수시점 확립 27
a. 리포터 대장균에서 스페어 획득 관찰 29
D. Record-seq 데이터 분석 31
a. Record-seq Library Data QC 31
b. DSS 염증성 장염 모델에서의 Record-seq 결과 37
c. DNBS를 사용한 대장염 모델에서의 Record-seq결과 43
d. DSS, DNBS를 통한 염증성 장질환 모델에서 DEG 비교 45
e. 장내 미생물총의 교란을 유도한 마우스에서 리포터 대장균의 전사체 비교 분석 47
IV. 고찰 50
V. 결론 52
VI. 참고문헌 53

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