Regulatory Role of RNF213 in Endothelial Function under Inflammatory Cytokine Stimulation
염증성 사이토카인 자극하 RNF213 의 내피기능 조절 역할
- 주제(키워드) RNF23 , inflammatory cytokines , endothelial dysfunction , angiogenesis , Moyamoya disease
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 이성준
- 발행년도 2026
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000035360
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Moyamoya disease (MMD) is characterized by a gradual occlusion of major intracranial arteries, accompanied by the development of unusual collateral vessels at the base of the brain. The molecular mechanisms that drive these vascular changes remain unclear. Recent studies have suggested that Ring Finger Protein 213 (RNF213), a major susceptibility gene for MMD, may regulate endothelial function, but its specific role under inflammatory stress has not been defined. In this study, we used human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with siRNA-mediated RNF213 knockdown to investigate how RNF213 deficiency alters endothelial responses to inflammatory stimulation. The analysis focused on barrier stability, angiogenic changes, and inflammatory signaling, with additional evaluation of whether these abnormalities could be ameliorated by cilostazol. Treatment with tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interferon gamma (IFNγ) increased RNF213 protein expression. It was accompanied by higher NFκB phosphorylation, increased VCAM-1 expression, and reduced eNOS phosphorylation, showing clear endothelial activation and dysfunction. The combined treatment of TNFα and IFNγ induced a synergistic inflammatory effect distinct from single cytokine stimulation and most strongly increased RNF213 expression. MTS and permeability assays showed reductions in both cell viability and barrier function under inflammatory stimulation and under RNF213 deficiency. In contrast, tube formation decreased with RNF213 deficiency, but cytokine stimulation in RNF213-deficient cells resulted in a pathologic partial restoration. RNF213 deficiency combined with inflammatory stimulation also affected pathways related to nitric oxide signaling and endothelial integrity. ZO-1 expression and eNOS phosphorylation were reduced, consistent with altered endothelial integrity and diminished nitric oxide signaling. In contrast, inflammatory signaling showed an unusual response pattern, as NFκB phosphorylation increased while MMP9 and VCAM-1 did not show their typical inflammatory induction. Cilostazol improved endothelial permeability in RNF213-deficient cells with cytokine stimulation, and this improvement was accompanied by a partial recovery of ZO-1 expression. However, its effect on tube formation remained limited, indicating that the drug primarily influenced junctional stability rather than angiogenic abnormalities in this model. Overall, these results indicate that RNF213 deficiency impairs endothelial function and barrier stability, and that inflammatory stimulation leads to response patterns that differ from a simple additive worsening. Although some indicators, such as cell viability, showed only modest additional decreases, alterations in endothelial integrity became more pronounced, and angiogenesis as well as molecular markers including NFκB, MMP9, and VCAM-1 showed altered patterns distinct from general inflammatory responses. These findings resemble the MMD pathology of endothelial dysfunction leading to arterial occlusions, unstable cellular integrity leading to increased hemorrhagic events, and pathologic moyamoya vessel formation. Keyword: RNF23, inflammatory cytokines, endothelial dysfunction, angiogenesis, Moyamoya disease
more초록/요약
모야모야병(Moyamoya disease, MMD)은 주요 뇌내 동맥의 점진적인 협착과 비정상적인 측부혈관 형성이 특징인 만성 뇌혈관 질환이다. 이러한 혈관 구조 변화를 유발하는 분자적 기전은 아직 명확히 규명되지 않았다. 최근 연구에서는 MMD의 주요 감수성 유전자인 RNF213이 내피세포 기능 조절에 관여할 가능성이 제시되었으나, 염증 자극 환경에서의 역할은 충분히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 siRNA 기반 RNF213 knockdown HUVEC 모델을 이용하여 RNF213의 기능이 염증 자극 조건에서 내피세포 반응에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 우리는 장벽 안정성, 혈관형성 변화, 염증 신호를 중심으로 분석하였으며 이러한 이상이 실로스타졸에 의해 회복될 수 있는지도 추가로 평가하였다. 인간 제대정맥 유래 내피세포(HUVECs)에 TNFα 및 IFNγ를 처리한 결과, RNF213 단백질 발현이 증가하였으며, NFκB 인산화 증가, VCAM-1 발현 상승, eNOS 인산화가 관찰되어 내피 활성화 및 기능장애가 확인되었다. TNFα와 IFNγ의 병합 자극은 단일 자극보다 더 강한 시너지 반응을 유도하였고, RNF213 발현을 가장 크게 증가시켰다. MTS 분석과 투과성 분석에서는 염증 자극과 RNF213 결손 모두에서 세포 생존성과 장벽 기능 저하가 관찰되었다. RNF213을 siRNA로 knockdown한 조건에서는 tube formation이 유의하게 감소하였고, RNF213 결손 상태에서의 염증 자극은 부분적이지만 병리적인 형태의 혈관형성 회복을 보였다. RNF213 결손과 염증 자극의 병행은 nitric oxide 신호 및 장벽 무결성과 관련된 경로에도 영향을 주었으며 ZO-1 발현과 eNOS 인산화의 감소가 확인되었다. 또한 NFkB 인산화는 증가한 반면, MMP9과 VCAM-1은 전형적 염증 반응과는 다른 패턴이 관찰되었다. 실로스타졸 처리는 RNF213 결손 및 RNF213 결손과 염증 처리의 병행 조건에서 내피 투과성을 개선하였으며, 이 효과는 ZO-1 발현의 부분적 회복과 동반되었다. 그러나 tube formation에 대한 효과는 제한적이었으며, 이는 실로스타졸이 혈관형성 장애보다 결합부위 안정성 회복에 더 직접적으로 작용함을 시사한다. 종합적으로, 본 연구는 RNF213 결손이 내피 기능과 장벽 안정성을 저하시킬 뿐만 아니라 염증 자극이 결합될 때 단순한 악화로 설명되지 않는 다양한 반응 패턴이 나타남을 보여준다. 이러한 결과는 RNF213 결손 조건에서 내피세포가 전형적인 염증 반응을 보이기도 하지만 다른 지표에서는 예상과 다른 반응을 보일 수 있으며, 이러한 변화가 MMD에서 관찰되는 내피 기능장애, 장벽 취약성 증가, 병리적 모야모야 혈관 형성 등 다양한 혈관 표현형과 연관될 가능성을 나타낸다. 핵심어: RNF213, 염증성 사이토카인, 내피기능장애, 혈관신생, 모야모야병.
more목차
INTRODUCTION 1
MATERIAL AND METHODS 6
A. Cell Culture 7
B. siRNA Transfection 7
C. Cytokine Stimulation 7
D.Western Blot Analysis 7
E.Cell Viability Assay (MTS Assay) 8
F. Endothelial Permeability Assay (Evans Blue-BSA Method) 9
G. Tube Formation Assay 9
H. Statistical analysis 10
RESULTS 11
A. Synergistic inflammatory stimulation enhances RNF213 expression and endothelial inflammatory activation 11
B. RNF213 knockdown disrupts endothelial function under inflammatory conditions 14
C. RNF213 knockdown and inflammatory stimulation results in decreased nitric oxide signaling pathway and altered barrier integrity 18
D. RNF213 knockdown with inflammatory stimulation leads to a distinct paradoxical inflammatory response 20
E. Cilostazol treatment attenuates endothelial dysfunction in RNF213-deficient cells under inflammatory conditions 22
DISCUSSION 24
CONCLUSION 32
REFERENCE 33
국문요약 41
