Analysis of Transcriptomic Changes During Mycoplasma Contamination and Elimination in CHO-K1 Cells
- 주제(키워드) Mycoplasma contamination , CHO-K1 transcriptome , Antibiotic and non-antibiotic treatment
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 박대찬
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000035076
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Mycoplasma is a well-known bacterial contaminant that infects mammalian cells, posing a significant risk to cell cultures used in laboratory settings. While various commercial reagents are available for eliminating mycoplasma from contaminated cultures, most are evaluated primarily based on their removal efficacy, and little is known about their impact on host cell gene expression. In this study, we investigated transcriptomic changes associated with mycoplasma contamination and its elimination using Chinese hamster ovary (CHO- K1) cells, which are widely used in protein production and laboratory assays. To distinguish effects induced from reagents for elimination from those caused by the elimination of mycoplasma itself, we compared two different treatments: BM-Cyclin (antibiotic-based) and BioMycoX reagent (amphidinol-based). We also analyzed transcriptomic profiles of cells after reagent withdrawal to assess recovery and to verify whether the reagent-induced transcriptomic effects exhibited similar expression patterns. Six experimental conditions were established by applying different contamination and treatment protocols: control, mycoplasma-contaminated, BM- Cyclin–treated, BioMycoX-treated, post-BM-Cyclin–treated, and post-BioMycoX- treated . Total RNA was extracted from each sample, and mRNA was sequenced using next-generation sequencing. Then, differentially expressed genes were identified based on transcript abundance across conditions. The BioMycoX-treated samples exhibited a distinct transcriptional profile characterized by strong downregulation of genes involved in cell cycle regulation and mitotic division, which were largely restored in the post-treatment samples. In contrast, mycoplasma contamination induced the upregulation of immune-like and motility-associated genes. The findings indicate that transcriptomic changes caused by mycoplasma contamination are reversible, and that elimination reagents themselves may influence gene expression.
more초록/요약
마이코플라즈마는 포유류 세포를 감염시키는 대표적인 세균 오염원으로, 실험실에서의 세포 배양에 심각한 위협이 된다. 마이코플라즈마를 제거하는 데 효과적인 다양한 시약이 있지만, 이들이 숙주 세포의 전사체에 미치는 영향에 대한 연구는 미흡하다. 본 연구에서는 단백질 생산과 유전자 실험에 널리 쓰이는 CHO-K1 세포를 이용해서 마이코플라즈마 감염 및 제거가 세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 특히 제거 시약이 세포에 주는 영향과 마이코플라즈마 감염 후 제거에 따른 영향을 구분하고자, 항생제 기반의 BM-cyclin 과 암피디놀계 화합물을 기반으로 한 CellSafe 사의 BioMycoX®Mycoplasma Elimination Kit 를 마이코플라즈마 제거에 각각 사용하였다. 또한 제거 약물 처리 종료 후 회복된 세포의 전사체를 분석해 시약 유래 전사체 변화의 지속 여부를 확인하였다. 총 여섯가지 조건(대조군, 마이코플라즈마 감염군, 항생제 기반 약물 처리군, 항생제 처리 후 회복군, 암피디놀 기반 약물 처리군, 암피디놀 처리 후 회복군)에서 차세대 시퀀싱 기술을 이용해 mRNA 시퀀싱을 했으며, 차등 발현 유전자 분석 및 기능적 경로 분석을 통해 전사체 변화를 정량화하였다. 그 결과, 항생제 기반 약물과는 다르게 암피디놀 기반 약물 처리군에서 세포주기 및 분열 관련 유전자의 발현이 강하게 억제되었으며, 암피디놀 처리 후 회복군에서는 이와 관련된 유전자들이 대부분 정상 수준으로 복구됨을 확인하였다. 세포주기 및 분열 관련 기능은 마이코플라즈마 감염시에도 유의미하게 저하되지 않은 기능으로, 이 결과는 마이코플라즈마와는 관계없이 암피디놀 기반 약물의 영향으로 보인다. 또한 감염과 제거 약물 처리 시 저하된 기능들이 제거 후에는 복구된 것으로 보아 마이코플라즈마 감염과 약물 처리에 의한 전사체 변화가 가역적임을 확인하였다. 마이코플라즈마 감염과 제거 이후의 전사체 회복 양상을 규명한 본 연구는, 세포 폐기 여부 판단과 제거 시약의 사용 전략을 세우는 데 있어 유용한 참고자료로 활용될 수 있을 것이다.
more목차
I. Introduction 1
A. CHO-K1 cell line 2
B. Mycoplasma contamination 3
C. Gene expression profiling 6
D. Objective of the thesis 7
Ⅱ. Materials and Methods 8
A. CHO-K1 cell culture 9
1. CHO-K1 cell culture 9
2. Mycoplasma contamination of cells 9
3. Mycoplasma elimination 10
B. Pre-analytic validation 12
1. Measurement of cell proliferation and mitochondrial activity using EZ- cytox 12
2. RNA extraction and cDNA synthesis 12
3. PCR for mycoplasma detection 13
4. PCR for cell type discrimination 16
C. Analysis of RNA-seq data 19
1. Sample preparation for mRNA sequencing 19
2. Mapping of reads on Cricetulus griseus reference genome 19
3. Gene expression quantification using RSEM 20
4. Data clustering and relationship among samples 20
5. Differentially expressed genes (DEG) analysis 21
6. Enrichment analysis of DEGs 22
6.1. Over-representation analysis (ORA) 22
6.2 Gene set enrichment analysis (GSEA) 23
Ⅲ. Results 25
A. Cell culture and pre-analysis validation 26
1. Cell morphological changes after mycoplasma elimination 26
2. EZ-cytox assay for measuring cell proliferation and mitochondrial activity 29
3. Mycoplasma detection by PCR 33
4. Cell type detection by PCR 40
B. Analysis of RNA-seq data 44
1. mRNA sequencing and quality assessment 44
2. Read alignment 44
3. Gene expression distribution and sample clustering 50
4. Analysis of differentially expressed genes 55
5. Functional analysis of DEGs 57
5.1 Functional alterations in Mycoplasma-contaminated and amphidinol-treated samples compared to control 57
5.2 Transcriptomic suppression and recovery following BioMycoX treatment 63
Ⅳ. Discussion 69
Ⅴ. References 74
Ⅵ. 국문요약 79
