Development of a novel selective endosomal Toll-like receptor inhibitor for the treatment of autoimmune diseases, etc.
자가면역 질환 등의 치료를 위한 새로운 선택적인 엔도솜 톨 유사 수용체 억제제 개발
- 주제(키워드) TLRs , Inhibitor , Autoimmune diseases , Endosomal TLRs , Drug development
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 최상돈, 김욱
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000034931
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Endosomal Toll-like receptors (TLR3, 7, 8, and 9) are pivotal pattern-recognition receptors initiating host immune responses by detecting pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and damage-associated molecular patterns (DAMPs). However, dysregulated activation of these receptors significantly contributes to the pathogenesis of numerous inflammatory and autoimmune diseases, including psoriasis, systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis, and myocardial infarction (MI). This aberrant signaling drives chronic inflammation and tissue damage, highlighting the urgent clinical need for highly effective and selective endosomal TLR inhibitors. This study describes the discovery, detailed preclinical characterization, and therapeutic potential of novel small-molecule inhibitors targeting these critical pathways. Initially, through rigorous structure-activity relationship (SAR)-based modifications, we identified and optimized two potent inhibitors, ETI41 and ETI60. These compounds selectively inhibited endosomal TLR-mediated pro-inflammatory signaling, exhibiting nanomolar activity (IC50: ETI41, ~100–1,000 nM; ETI60, ~20–300 nM) against TLR3, 7, and 9, without affecting surface TLRs (TLR1/2, 2/6, 4, 5). Mechanistically, ETI41 and ETI60 inhibited phosphorylation of MAPKs (p-ERK, p-JNK, p-p38), prevented nuclear translocation of NF-κB p65, reduced Iκ-Bα degradation, and suppressed IRF7 expression. RNA sequencing analysis further revealed modulation of pro-inflammatory genes such as IL1-β, CXCL2, TNF, and NLRP3 in IMQ-induced RAW 264.7 cells. In preclinical in vivo studies, oral administration of ETI41 or ETI60 significantly ameliorated disease symptoms in IMQ- and IL-23-induced psoriasis models, demonstrated by reduced PASI scores, epidermal acanthosis, dermal thickness, keratinocyte proliferation, and expression of inflammatory cytokines (IL-17A, IL-23). Additionally, in a female MRL/lpr mouse model of SLE, these inhibitors notably alleviated clinical manifestations, lymph node enlargement, and serological markers (ANA, anti-dsDNA antibodies), outperforming hydroxychloroquine at lower doses. Considering the role of TLR9 in post-MI inflammation, we developed ETA53, a novel, highly selective TLR9 antagonist. Using an integrated computational and experimental drug discovery approach, ETA53 was identified as exceptionally specific, binding selectively to the CpG motif antagonistic ODN site (Site II) of TLR9 with low nanomolar potency (IC50: ~4.8–14.16 nM). Pharmacokinetic assessments indicated sufficient systemic exposure, and preclinical efficacy studies showed ETA53 significantly improved cardiac function (EF from ~50% to ~80%), reduced infarct size, fibrosis, and inflammation, and normalized expression of genes linked to cardiac remodeling and inflammatory responses. Preliminary studies also indicated potential therapeutic applications in autoimmune skin inflammation. Collectively, these findings underscore the successful development of ETI41, ETI60, and ETA53 as selective endosomal TLR inhibitors with robust therapeutic efficacy and favorable drug-like properties. These compounds demonstrate significant potential for advancing treatments across a broad spectrum of autoimmune and inflammatory conditions, warranting further clinical translation to establish definitive efficacy and safety profiles.
more초록/요약
엔도솜 Toll-like receptor(TLR3, 7, 8, 9)는 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)을 인식하여 숙주의 면역반응을 유도하는 중요한 패턴 인식 수용체입니다. 그러나 이들 수용체의 조절되지 않은 활성화는 건선, 전신홍반루푸스(SLE), 류마티스 관절염 및 심근경색(MI)을 포함한 다양한 염증성 및 자가면역 질환의 병인에 중대하게 기여합니다. 이러한 비정상적인 신호 활성화는 만성 염증 및 조직 손상을 유발하므로, 효과적이고 선택적인 엔도솜 TLR 억제제 개발의 임상적 필요성이 매우 높습니다. 본 연구에서는 이러한 중요한 신호 경로를 표적으로 하는 신규 저분자 억제제들의 발굴과 상세한 전임상 특성 분석 및 치료적 잠재력을 제시하였습니다. 먼저, 엄격한 구조-활성 관계(SAR) 기반의 화합물 개량을 통해 두 가지 강력한 억제제인 ETI41과 ETI60을 도출하고 최적화하였습니다. 이 화합물들은 TLR3, 7, 9가 매개하는 염증성 신호를 선택적으로 억제하며, 나노몰 수준의 우수한 활성(IC50: ETI41, 약 100–1,000 nM; ETI60, 약 20–300 nM)을 나타냈으며, 세포 표면 TLR(TLR1/2, 2/6, 4, 5)의 활성에는 영향을 미치지 않았습니다. ETI41과 ETI60은 기전적으로 MAPK의 인산화(p-ERK, p-JNK, p-p38)를 억제하고, NF-κB p65의 핵 내 전위를 저해하며, Iκ-Bα의 분해를 감소시키고 IRF7의 발현을 억제하였습니다. RNA 시퀀싱 분석에서는 IMQ로 유도된 RAW 264.7 세포에서 IL1-β, CXCL2, TNF, NLRP3와 같은 염증성 유전자 발현이 조절됨을 확인하였습니다. 전임상 생체내 연구에서 ETI41과 ETI60의 경구 투여는 IMQ 및 IL-23 유도 건선 모델에서 PASI 점수, 표피 증식, 진피 두께, 각질세포 증식 및 염증성 사이토카인(IL-17A, IL-23)의 발현을 유의하게 감소시키며 질병 증상을 개선하였습니다. 또한, 암컷 MRL/lpr 루푸스 생쥐 모델에서도 ETI41과 ETI60은 기존 치료제인 하이드록시클로로퀸보다 낮은 용량에서도 임상 증상, 림프절 비대, ANA 및 항이중가닥 DNA 항체와 같은 혈청 지표를 유의하게 완화하였습니다. 한편, TLR9가 심근경색 후 염증 반응에서 가지는 역할을 고려하여, 신규 선택적 TLR9 길항제인 ETA53을 개발하였습니다. ETA53은 전산적 접근법과 실험적 약물탐색을 통합하여 도출된 화합물로서, TLR9의 CpG 모티프 길항성 ODN 결합 부위(Site II)에 선택적으로 결합하며 매우 높은 특이성과 낮은 나노몰 수준의 활성(IC50: 약 4.8–14.16 nM)을 나타냈습니다. 약동학적 평가 결과 충분한 전신 노출을 보였으며, 전임상 효능 평가에서는 ETA53이 심장 기능(EF 약 50%에서 약 80%로 개선)을 현저히 향상시키고, 심근 경색 크기, 섬유화, 염증을 감소시키며 심장 리모델링 및 염증 반응 관련 유전자 발현을 정상화하는 것으로 나타났습니다. 추가 예비 연구에서는 자가면역 피부 염증 치료에 대한 가능성도 제시하였습니다. 종합적으로 본 연구 결과는 ETI41, ETI60, ETA53이 선택적 엔도솜 TLR 억제제로서 우수한 치료 효능과 양호한 약물학적 특성을 갖추었음을 보여줍니다. 이 화합물들은 다양한 자가면역 및 염증 질환 치료제로서 높은 잠재성을 지니고 있으며, 향후 임상 연구를 통해 최종적인 효능과 안전성 프로파일을 확립할 필요가 있습니다.
more목차
CHAPTER 1: Endosomal toll-like receptor inhibitor drug discovery through a preclinical validation process for autoimmune diseases 1
1.1. Introduction 2
1.2. Candidate selection and validation 3
1.3. Validating key pathways based on endosomal TLR downstream signaling 7
1.4. Elucidation of the mechanism involving direct binding to the cross-validated inhibitor 10
1.5. Complete therapeutic effects of the selected inhibitor for psoriasis 13
1.6. Potential therapeutic effects of the selected inhibitor for other autoimmune diseases 16
1.7. Conclusion 19
CHAPTER 2: Discovery of a Selective Toll-Like Receptor 9 Inhibitor for Treatment of Myocardial Infarction 22
2.1. Introduction 23
2.2. Identification of specific TLR9 inhibitors that was predicted to bind at the CpG motif binding site 24
2.3. ETA53 inhibition is specific for site II of TLR9. 28
2.4. ETA53 is TLR9-specific, which is not restricted to certain species or ligands 30
2.5. ETA53 exhibited valid therapeutic effects on cardiac appearance and functions in myocardial infarction 33
2.6. ETA53 showed effective therapeutic changes in molecular markers in myocardial infarction 37
2.7. Conclusion 41
CHAPTER 3: Materials and Methods 44
3.1. Cell line preparation 45
3.2. Ligand preparation 45
3.3. Protein based competitive enzyme-linked immunosorbent assay 45
3.4. Surface Plasmon Resonance (SPR) Analysis 45
3.5. MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) assay 46
3.6. Water-soluble tetrazolium assay 46
3.7. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 46
3.8. Western blot analysis 47
3.9. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 47
3.10. QuantSeq 3′ mRNA sequencing analysis (In vitro) 48
3.11. FACS analysis 48
3.12. pH assay 48
3.13. Pharmacokinetic profiling 48
3.14. Murine psoriasis model 48
3.15. Murine SLE model 49
3.16. Establishment of a rat model for acute myocardial infarction 50
3.17. Histological analysis for acute myocardial infarction 50
3.18. Assessment of hemodynamic parameters using a pressure-volume catheter in rats 51
3.19. QuantSeq 3ʹ mRNA-seq analysis (In vivo) 51
3.20. Molecular docking for ETI 51
3.21. Structure-based virtual screening and molecular docking for ETA 52
3.22. Statistical methods 52
CHAPTER 4: References 53
CHAPTER 5: 초록 58
