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The analysis of signaling axis induced by DNA Polymerase beta and ATM deficiency related to cerebellar ataxia

DNA Polymerase β 및 ATM 불활성화에 의해 유도되는 신호 전달 경로와 소뇌성 운동 실조와의 연관성

  • 이다롬 (Darom Lee, 아주대학교 일반대학원)

초록/요약

Cerebellar ataxia, a defining feature of neurodegeneration in ataxia-telangiectasia (A-T), has been associated with impairments in the DNA damage response (DDR). However, the exact molecular mechanisms remain incompletely understood due to limited access to human tissue at early disease stages. In this study, I investigated cerebellar transcriptomic changes in enriched Purkinje cells isolated from postnatal day 21 Polb and Atm double knockout (DKO) mice, which serve as a model of A-T with aggravated neurological symptoms. RNA sequencing analysis revealed significant downregulated genes involved in the mGluR1–PKCγ signaling cascade, including Itpr1, Camk2a, Car8, and Grid2ip, which are critical for calcium signaling and long-term depression (LTD) at Purkinje cell synapses. These alterations suggest a disruption of synaptic plasticity as a central mechanism underlying ataxia in DKO mice. Additionally, I observed the upregulation of inflammation- related genes, such as Jmjd3 (Kdm6b) and Igf2bp2, indicative of a chronic stress response associated with persistent DNA damage in Purkinje cells. Taken together, our findings indicate that the combined loss of POLB and ATM perturbs both synaptic signaling and stress response pathways, thereby contributing to cerebellar dysfunction and the onset of ataxia. This work provides important molecular insights into how DDR deficiencies compromise Purkinje cell homeostasis and neuronal viability, suggesting new avenues for therapeutic intervention in A-T and related cerebellar ataxia.

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초록/요약

소뇌성 운동 실조(cerebellar ataxia)는 A-T(ataxia-telangiectasia)에서 관찰되는 대표적인 신경퇴행성 증상으로, DNA 손상 반응(DNA damage response, DDR)의 결함과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 질병 초기 단계에서의 인간 조직 접근성의 한계로 인해, 그 정확한 분자적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 Polb와 Atm 유전자가 이중으로 결손 된 마우스의 Purkinje 세포에서 발생하는 소뇌 전사체 수준의 변화를 분석하였다. 생후 21일령 마우스의 소뇌로부터 Percoll gradient를 이용해 Purkinje 세포를 농축한 뒤, RNA 시퀀싱 분석을 수행하였다. 전사체 분석 결과, Itpr1, Camk2a, Car8, Grid2ip 등 mGluR1–PKCγ 신호 경로에 관련된 유전자들이 유의하게 하향 조절되어 있었으며, 이 유전자들은 모두 평행섬유–Purkinje 세포 시냅스에서의 칼슘 신호전달과 장기억제(LTD)에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 발현 감소는 이중 녹아웃 마우스에서의 운동 실조 발생 기전에 시냅스 가소성 손상이 중심적인 원인임을 시사한다. 동시에, Jmjd3(Kdm6b) 및 Igf2bp2 등 염증 반응과 관련된 유전자들이 상향 조절되어, Purkinje 세포 내에서 만성적인 DNA 손상에 따른 스트레스 반응이 유도되고 있음을 보여주었다. 이러한 결과들은 POLB와 ATM의 이중 불활성화가 신경세포의 신호전달 경로와 DNA 손상 반응 경로를 동시에 교란시켜 소뇌 기능 저하 및 운동 실조를 초래할 수 있음을 시사한다. 본 연구는 DDR 결함이 Purkinje 세포 항상성 및 신경 퇴행에 어떤 영향을 미치는지를 분자 수준에서 제시하며, A-T 및 관련 질환의 치료 타겟 발굴에 중요한 단서를 제공한다.

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목차

I. Introduction 1
II. Materials and Methods 4
1. Animal maintenance 4
2. Immunohistochemistry 5
3. Percoll gradient and Purkinje cell enrichment 6
4. Western blot 7
5. SMARTer RNA-seq 7
6. RNAseq analysis 8
7. Gene Ontology (GO) and Pathway enrichment analysis 8
8. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 9
III. Results 10
1. p53 deficiency could not rescue ataxic phenotypes in PolbNes-CreAtm-/- mice. 10
2. p53 deficiency dose not contribute to anatomical defects in the cerebellum of PolbNes-CreAtm-/- mice. 15
3. Purkinje cells were efficiently enriched from the cerebellum of PolbNes-CreAtm-/- mice using Percoll gradient centrifugation. 18
4. Gene expression analysis of enriched Purkinje cells from PolbNes-CreAtm-/- mice revealed upregulation of inflammation-associated genes. 21
5. Gene expression analysis of enriched Purkinje cells from PolbNes-CreAtm-/- mice revealed downregulation of genes involved in the calcium homeostasis pathway. 31
6. Differential gene expressions were confirmed by qRT-PCR and Western blotting. 37
7. Immunohistochemistry shows the defects of gene expression in Purkinje cells regardless of p53 status, which the animal models display cerebellar ataxia. 41
IV. Discussion 44
V. References 47
국문 초록 52

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