Identification of Drosophila Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase-like 4 as a dual regulator of PERIOD in Drosophila circadian clock
초파리 생체시계에서 Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase-like 4 가 이중 조절자로서 PERIOD 를 조절하는 기전에 대한 연구
- 주제(키워드) Drosophila , Circadian clock , PER , PPIase , dPPIL4
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 김은영
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000034848
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
The circadian clock system is a well-conserved system in living organisms on Earth. It enables animals to expect and adapt to environmental changes, resulting in ~24-hour rhythms of behavior and physiology. The molecular mechanism of the circadian clock, known as the transcription-translation feedback loop (TTFL), regulates the synthesis, function, and degradation of core circadian clock proteins in a 24-hour cycle. To precisely control this TTFL, core circadian clock proteins undergo various post-translational modifications (PTMs). Thus, a comprehensive understanding of these mechanisms is needed for a deeper insight into the molecular basis of circadian regulation. Based on this, I hypothesized that protein conformational changes induced by proline isomerization, a novel PTM, play a role in the fine-tuning of the circadian clock mechanism. In this thesis, I investigated the mechanism by which Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase (PPIase) enzymes regulate the circadian clock in Drosophila. First, I performed RNA interference (RNAi)-mediated knockdown of PPIase genes in circadian clock cells and analyzed the locomotor rhythms of the corresponding flies. Among 29 PPIase knockdown strains, 20 exhibited lengthened circadian periods. Among these, CG5808 showed the most pronounced alteration in the circadian period, prompting further functional analysis. CG5808 belongs to the cyclophilin family of PPIases and is an ortholog of mammalian Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase-like 4 (Ppil4). Therefore, CG5808 was designated as Drosophila Ppil4 (dppil4). Second, I examined the expression pattern of dPPIL4 in the Drosophila’s brain and found that it is ubiquitously expressed in the nucleus of brain cells throughout the day. Third, I observed that RNAi-mediated knockdown of dppil4 in circadian clock cells resulted in a global reduction of PERIOD (PER) protein levels in small ventral lateral neurons (sLNvs) throughout the day. Furthermore, restoring PER expression rescued the prolonged circadian period observed in dppil4 knockdown flies, indicating that the extended period phenotype was due to reduced PER levels. Fourth, to elucidate the molecular mechanism underlying this phenotype, I demonstrated that dPPIL4 regulates PER levels through two mechanisms: (1) modulation of RNA polymerase II (RNAPII) activity in the evening, thereby influencing period (per) transcription, and (2) regulation of the Skp1- CUL1-F-box protein (SCF) complex component Cullin-1 (CUL1) in the early morning, thereby promoting PER degradation. Collectively, this study reveals that the PPIase dPPIL4 plays a dual role in the regulation of Drosophila circadian rhythms by facilitating both the production and degradation of PER, ensuring the proper maintenance of PER amplitude within the circadian system.
more초록/요약
생체시계는 지구상의 생명체에 보존 되어있는 시스템으로서, 동물이 외 부환경을 예측 및 적응할 수 있게 하며, 그 결과 약 24시간의 행동 및 생리 리 듬이 생긴다. 생체시계의 분자기전인 TTFL을 통해 24시간을 주기로 핵심 생체 시계 단백질들이 올바른 시간에 생성되고 적절하게 기능을 한 후 분해된다. 이 러한 TTFL을 정교하게 조절하기 위해, 핵심 생체시계 단백질들은 다양한 PTM 이 일어나기 때문에 이 기전을 이해하는 것이 생체시계 분자기전을 깊게 이해 하는 데에 필요하다. 그러므로 나는 새로운 PTM으로서 proline isomerization으로 인한 단백질의 conformational change와 그로 인한 단백질 기능 변화가 생체시계 분자기전을 조절할 것이라고 가정했다. 그러므로 이 학위 논문에서는 PPIase 효소들이 초파리 생체시계 분자기 전을 조절하는 메커니즘을 연구했다. 첫 번째로, PPIase 유전자들을 RNAi를 이 용하여 생체시계 세포에서 발현저하한 후, 해당 초파리의 생체리듬을 관찰했다. 그 결과, 29개의 PPIase 발현저하 초파리 중에서 20개의 초파리의 주기가 길어 졌다. 그 중에서 가장 주기가 많이 변화한 CG5808 유전자의 기능을 연구했다. CG5808은 cyclophilin 계열의 PPIase로서 포유류 Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase like-4 (ppil4)의 ortholog이다. 따라서 CG5808을 Drosophila ppil4 (dppil4)로서 명명 했다. 두 번째로, dPPIL4가 초파리 뇌 세포의 핵에서 하루동안 일정하게 발현하 는 것을 확인했다. 세 번째로, dppil4가 생체시계 세포에서 발현이 저하됐을 때, sLNvs 세포에서 PERIOD (PER)의 양이 하루동안 전반적으로 감소하며 PER의 양 을 회복시켜주자 dppil4 발현저하 초파리의 길어진 주기가 회복되는 것을 확인 하여, dppil4 발현저하 초파리의 주기가 길어진 원인이 PER의 양이 감소한 것임 을 알 수 있었다. 네 번째로, 이러한 표현형의 분자적 기전을 밝히기 위해, dPPIL4가 두 가지 경로를 통해 PER 단백질 수준을 조절함을 입증하였다. (1) 저 녁 시간대에는 RNA polymerase II (RNAPII)의 활성을 조절하여 period (per) 유전 자의 전사를 조절하고, (2) 이른 아침 시간대에는 Skp1-CUL1-F-box protein (SCF) complex의 구성 요소인 Cullin-1 (CUL1)을 조절함으로써 PER의 분해를 촉진한다 는 것을 밝혔다. 종합해보면, PPIase인 dPPIL4는 초파리 생체시계의 핵심 단백질인 PER 의 생성과 분해 두 가지를 모두 도와주어 PER의 amplitude가 적절히 유지되도 록 도와주는 것을 밝혔다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
1. Circadian timing system 1
2. Circadian clock cell network 1
3. Molecular mechanism of circadain clock 2
4. Post-tranlational modification of clock proteins 3
5. Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase 5
6. Aims of the study 6
II. Materials and Methods 8
1. Fly stocks 8
2. Transgenic fly generation 9
3. Locomotor behavior analysis 9
4. Western blotting and immunoprecipitation 10
5. Immunohistochemistry and confocal imaging 11
6. Real-time quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 12
7. RNA sequencing and data analysis 13
8. DEXseq 14
9. Feeding assay 15
10. PER degradation rate analysis: cycloheximide (CHX) treatment 15
11. Statistical analysis 16
III. RESULTS 17
1. PPIases knockdown Drosophila mostly shows a long period 17
2. dppil4 knockdown in clock cells lengthens the free-running period 21
3. dPPIL4 is requried for Drosophila development 29
4. dPPIL4 ubiquitously expressed in brain icluding clock cells and is localized in the nucleus 32
5. Reduced PER levels are responsible for the long period of dppil4 KD flies 40
6. dPPIL4 regulates both per RNA and PER protein 50
7. dPPIL4 supports per transcription via RNA polymerase II CTD pSer5 regulation 59
8. dPPIL4 regulates PER degradation by stabilizing CUL1 in SCFSlimb complex 70
IV. DISCUSSION 77
V. CONCLUSION 83
REFERENCES 84
국문요약 94
