Enhanced Crocetin Production in Saccharomyces cerevisiae via Metabolic Engineering
대사공학을 통한 사카로마이세스 세레비지에에서의 크로세틴 생산 증대
- 주제(키워드) Crocetin , Saccharomyces cerevisiae , Metabolic Engineering
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 이평천
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000034822
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Crocetin is a pharmacologically active apocarotenoid with antioxidant, anti- inflammatory, and neuroprotective properties. However, its commercial production remains limited due to the low efficiency and scalability of traditional plant-based extraction methods. We developed an enhanced crocetin-producing Saccharomyces cerevisiae platform by optimizing the precursor pathway and screening CsCCD2 variants with improved enzymatic activity. We first screened CsCCD2 variants and selected a highly active mutant (R192F/S323A) based on known functionally relevant residues. This mutant then introduced into the genome of the strain already expressing wild- type CsCCD2, with insertion targeted to the CIT2 locus to enhance acetyl-CoA availability. This modification led to a 5.4-fold enhancement in crocetin yield compared to the strain expressing only the wild-type CsCCD2, reaching a final titer of 2.8 ± 0.79 mg/L. Importantly, these improvements were observed only after CsALDH3I1 was introduced. The introduction of CsALDH3I1 resulted in a 3.1-fold increase with two copies of wild-type CsCCD2 in comparison with the strain expressing a single copy of wild-type CsCCD2, and a further 1.7-fold increase when one copy was replaced with the CsCCD2 R192F/S323A variant. The results highlight the importance of resolving both upstream and downstream bottlenecks in crocetin biosynthesis. Additionally, crocetin was mainly detected in the culture medium in strains expressing two copies of CsCCD2, suggesting a shift toward extracellular accumulation. This study provides a stable platform that can support future efforts toward crocin biosynthesis.
more초록/요약
크로세틴은 항산화, 항염증, 신경보호 효과를 가진 약리 활성 아포 카로티노이드로 알려져 있으나, 기존 식물 기반 추출법의 낮은 효 율성과 생산 규모의 한계로 인해 상업적 생산이 제한되고 있다. 본 연구에서는 효소 개량과 전구체 경로 최적화를 통해 사카로마이세 스 세레비지에에서의 크로세틴 생산량을 증가시키고자 하였다. 먼 저, 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소 유전자 변이체를 스크리닝 한 결과, 기능적으로 중요한 잔기를 기반으로 변형된 R192F/S323A 이중 변이체가 가장 활성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 해당 변 이체를 야생형 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소를 발현하는 균 주의 유전체에 통합하였으며, 이는 전구체인 아세틸-CoA의 가용성 을 높이기 위해 시트르산 합성효소 유전자 자리에 삽입되었다. 그 결과, 야생형 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소만 발현하는 균주 대비 크로세틴 생산량이 5.4배 증가하였다. 이러한 생산성 증가는 알데히드 탈수소효소 유전자를 도입하였을 때에만 관찰되었으며, 야생형 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소 유전자를 두 사본 발현 하는 균주에서는 한 사본만 발현하는 균주보다 3.1배 증가하였고, 이 중 하나를 R192F/S323A 변이로 대체한 경우 추가로 1.7배 증가 하였다. 이 결과는 크로세틴 생합성 경로의 상류와 하류 병목 모두 를 해결하는 것이 중요함을 시사한다. 또한, 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소 유전자를 두 사본 발현하는 균주에서는 크로세틴이 주 로 배지에서 검출되어, 세포 외로의 분비 경향이 있음을 보여준다. 본 연구는 향후 크로신 생산을 위한 전구체로서, 안정적으로 크로 세틴을 생산하는 균주를 제공한다.
more목차
1. Introduction 1
2. Materials and Methods 4
2.1 Strains, Media and Culture Conditions 4
2.2 Plasmid construction and site-directed mutagenesis of CsCCD2 variants 5
2.3 Strain construction 6
2.4 Extraction of carotenoids 6
2.5 Analysis of HPLC-DAD 7
3.Results 12
3.1 Screening of CsCCD2 variants for enhanced crocetin production 12
3.2 Comparison of crocetin production by site-directed CsCCD2 variants 15
3.3 Comparison of crocetin production by CsCCD2 variants under enhanced mevalonate pathway flux 17
3.4 Chromosomal integration of CsCCD2 R192F/S323A into ZPE and ZPEC strains 19
3.5 Chromosomal integration of CsALDH3I1 into ZPEC, ZPECC, ZPECCm strains 22
3.6 Kinetic analysis of crocetin biosynthesis in the ZPECCmA strain 25
3.7 Optimization of Ferrous Ion concentration for enhanced crocetin production in the ZPECCmA strain 27
3.8 Optimization of Nicotinic acid concentration for enhanced crocetin production in the ZPECCmA strain 30
4. Discussion 33
5. References 35
ABSTRACT IN KOREAN 39
