Design and Evaluation of Anthocyanin-Polysaccharide Nanocomplex for Enhanced Phytomedicine Delivery
- 주제(키워드) Aronia bioactive fraction-alginic acid nanocomplex , Aronia bioactive fraction-fucoidan nanocomplex , Electrostatic interaction , Nanoparticles , Stability , Neuroinflammation , Aβ aggregation , Immune checkpoint inhibitors , Immunotherapeutic activity
- 주제(DDC) 615.1
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 이범진
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000034724
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Anthocyanins derived from Aronia melanocarpa possess significant anti-cancer and anti-inflammatory properties, making them valuable for the chemoprevention of various diseases, including diabetes, obesity, and cancer. However, their primary drawback is their low stability. In this context, we prepared a nanocomplex with negatively charged polysaccharides to enhance structural stability. This thesis developed an aronia bioactive fractions (ABFs)-polysaccharide nanocomplex and applied it to Alzheimer's Disease and colorectal cancer, presenting its potential as a therapeutic agent. Chapter I demonstrated that aronia bioactive fraction-alginic acid nanocomplex (AANCP) could reduce inflammatory cytokines and promote amyloid-beta phagocytosis, thereby decreasing amyloid-beta aggregation. Anthocyanins have been reported to penetrate the blood-brain barrier and have demonstrated potential in mitigating pathologies associated with Alzheimer’s disease (AD), including neuroinflammation, amyloid beta (Aβ) fibrillogenesis, and cognitive impairment. Nonetheless, the therapeutic efficacy of anthocyanins is constrained by their low stability. In response to this limitation, we developed an AANCP via electrostatic molecular interactions to improve the structural stability of ABF and the formation of nanoparticles. To investigate the in vitro effects of AANCP, we assessed its inhibitory activity against lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory cytokines in BV2 cells utilizing enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results indicated that AANCP effectively inhibited the secretion of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 triggered by LPS. Furthermore, we examined the transition from the M1 to the M2 microglial phenotype induced by Aβ through quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), revealing that AANCP significantly increased microglial Aβ phagocytosis by triggering receptor expressed on myeloid cell 2-related microglial polarization. Additionally, we investigated the inhibition of Aβ aggregation via Thioflavin T (ThT) analysis, demonstrating that AANCP markedly suppressed Aβ aggregation. To assess the potential of AANCP in ameliorating cognitive impairment, we employed Donepezil as a positive control in an in vivo model of scopolamine- induced dementia, finding that AANCP significantly alleviated cognitive impairment. Taken together, AANCP rapidly formed nanoparticles characterized by a negative zeta potential, which disrupted the hydration of anthocyanins and enhanced their intestinal absorption. Particularly, AANCP induced phenotypic alterations in microglia, leading to a reduction in inflammatory cytokine production while promoting Aβ phagocytosis and decreasing Aβ aggregation. Consequently, AANCP suggests itself as a potentially effective therapeutic agent for the management of Alzheimer's disease. Chapter II showed that aronia bioactive fraction-fucoidan nanocomplex (AFNC) effectively hindered the PD-1/PD-L1 interaction and boosted the efficacy of immunotherapy. Chemotherapy has been widely used for the treatment of colorectal cancer, but it often results in various side effects. Consequently, immunotherapy has emerged as a promising alternative to chemotherapy. The primary targets of immunotherapy are PD-1 and PD-L1, and immune checkpoint inhibitors (ICIs) have been effective against various cancers. Additionally, anthocyanins have been reported to possess anticancer activity, though their stability is low. All immune checkpoint inhibitors are known to have a high molecular weight, have immune- related side effects, and exhibit low responsiveness. To overcome these drawbacks of immunotherapy, we prepared an AFNC using the negatively charged polysaccharide fucoidan to enhance the stability of ABF. Anthocyanins have been reported to exhibit anticancer activity, particularly enhancing ICI activity. Additionally, fucoidan has been reported to be a promising candidate for enhancing immunotherapy. To investigate the in vitro effects of AFNC, we evaluated its inhibitory activity on the interaction between PD-1 and PD-L1 using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the results demonstrated that AFNC inhibited the PD-1/PD-L1 interaction. Subsequently, we evaluated the immunotherapeutic activity of AFNC using an MC38 cell allograft humanized PD-1 mouse model. The treatment of AFNC in combination with pembrolizumab resulted in improved anticancer activity compared to pembrolizumab alone, resulting in a synergistic effect. Consequently, these findings suggest that AFNC can inhibit the PD-1/PD-L1 interaction and enhance immuno-oncologic effects when combined with ICI.
more초록/요약
Aronia melanocarpa에서 유래한 안토시아닌은 항암 및 항염증 특성이 뛰어나 당뇨병, 비만, 암과 같은 다양한 질병의 화학적 예방에 유용합니다. 그러나 이들의 주요 단점은 안정성이 낮다는 것입니다. 이러한 맥락에서 우리는 구조적 안정성을 높이기 위해 음전하를 띠는 다당류를 활용한 나노복합체를 준비했습니다. 본 논문에서는 알츠하이머병과 대장암에 적용하여 치료제로서의 가능성을 보이는 안토시아닌-다당류 나노복합체를 개발했습니다. 1장에서는 AANCP가 염증성 사이토카인을 감소시키고 아밀로이드 베타 식세포 작용을 촉진하여 아밀로이드 베타 응집을 감소시킬 수 있음을 입증하였습니다. 안토시아닌은 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 것으로 보고되었으며, 알츠하이머병(AD)과 관련된 병리, 즉 신경 염증, 아밀로이드 베타(Aβ) 섬유화, 인지 장애를 완화하는 잠재력을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고 안토시아닌의 치료 효능은 낮은 안정성에 의해 제한됩니다. 이러한 한계에 대응하기 위해, 우리는 안토시아닌의 구조적 안정성과 나노입자의 형성을 개선하기 위한 정전기적 분자 상호작용을 통해 안토시아닌-알긴산 나노복합체(AANCP)를 개발했습니다. AANCP의 in vitro 효과를 조사하기 위해, 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 이용하여 BV2 세포에서 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 유도된 전염증성 사이토카인에 대한 억제 활성을 평가했습니다. 그 결과, AANCP는 LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 분비를 효과적으로 억제했습니다. 또한, 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통해 아밀로이드 베타에 의해 유도된 M1에서 M2 미세아교세포 표현형의 전환을 조사했으며, AANCP가 미세아교세포의 아밀로이드 베타 포식을 유도하여 미세아교세포의 극성 변화를 유의미하게 증가시켰음을 밝혔습니다. 추가로, Thioflavin T (ThT) 분석을 통해 아밀로이드 베타 응집 억제를 조사했으며, 그 결과 AANCP가 아밀로이드 베타 응집을 현저히 억제함을 보여주었습니다. AANCP가 인지 장애를 개선하는 잠재력을 평가하기 위해, 스코폴라민에 의해 유도된 in vivo 치매 모델에서 양성 대조군으로 도네페질(Donepezil)을 사용했으며, AANCP가 인지 장애를 유의미하게 완화함을 발견했습니다. 종합하면, AANCP는 음의 제타 전하로 특징 지어지는 나노입자를 신속하게 형성하여 안토시아닌의 수화를 방지하고 장내 흡수를 향상시켰습니다. 특히, AANCP는 미세아교세포의 표현형 변화를 유도하여 염증성 사이토카인 생성을 감소시키고 아밀로이드 베타 식세포 작용을 촉진하며 아밀로이드 베타 응집을 감소시켰습니다. 결과적으로, AANCP가 알츠하이머병 관리에 효과적인 치료제로서 가능성이 있음을 제안합니다. 2장에서는 AFNC가 PD-1/PD-L1의 상호작용을 억제하고 면역요법 활성을 증진시킬 수 있음을 보여주었습니다. 대장암 치료를 위해 화학요법이 널리 사용되어 왔지만, 다양한 부작용이 종종 발생합니다. 따라서 면역요법이 화학요법을 대체할 수 있는 유망한 대안으로 부상하였습니다. 면역요법의 주요 표적은 PD-1과 PD-L1이며, 면역관문억제제(ICIs)는 다양한 암에 효과적입니다. 또한, 안토시아닌은 항암 활성을 가진다고 보고되었으나 그 안정성이 낮습니다. 모든 면역관문억제제는 분자량이 크고 면역 관련 부작용이 있으며 반응성이 낮은 것으로 알려져 있습니다. 이러한 면역요법의 단점을 극복하기 위해 음전하를 띠는 다당류인 후코이단을 사용하여 안토시아닌의 안정성을 높인 안토시아닌-후코이단 나노복합체(AFNC)를 준비하였습니다. 안토시아닌은 특히 면역관문억제제의 활성을 증진시키는 항암 활성을 보인다고 보고되었고, 후코이단도 면역요법을 증진시키는 유망한 후보로 보고되었습니다. AFNC의 in vitro 효과를 조사하기 위해 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 활용하여 PD-1/PD-L1 상호작용 억제 활성을 평가하였으며, 그 결과 AFNC가 PD-1/PD-L1 상호작용을 억제함을 입증하였습니다. 이후 AFNC의 면역치료 활성을 평가하기 위해 MC38 세포 동종이식 인간화 PD-1 마우스 모델을 사용하였습니다. AFNC를 pembrolizumab과 병용 처리하면 pembrolizumab 단독 처리군에 비해 항암 활성이 향상되어 시너지 효과가 나타났습니다. 따라서 이러한 결과는 AFNC가 PD-1/PD-L1 상호작용을 억제하고 면역관문억제제와 병용 시 면역항암 효과를 증진시킬 수 있음을 시사합니다.
more목차
Chapter I. Modulation of Neuroinflammation and Inhibition of Aβ Aggregation by a Novel Aronia Bioactive Fraction-Alginic Acid Nanocomplex 1
1. Introduction 1
2. Materials and methods 8
2.1. Materials 8
2.2. Preparation and characterization of AANCP 8
2.2.1. AANCP's manufacturing process 8
2.2.2. AANCP preparation 9
2.2.3. Physical characterization of AANCP 10
2.3. Release characteristics of AANCP 10
2.4. Chemical stability test 11
2.5. Cell culture of BV2 microglial and HT22 hippocampal neuronal cells 12
2.6. Cell viability assay 13
2.7. Analysis of pro-inflammatory cytokine secretion from microglia 14
2.8. Analysis via quantitative reverse transcription polymerase chain reaction 15
2.9. Immunocytochemical analysis of microglial phagocytosis 17
2.10. Image acquisition and analysis 19
2.11. Thioflavin T assay for the aggregation of Aβ42 19
2.12. Animal studies and oral administration in mice 20
2.13. Y-maze test 22
2.14. Passive avoidance test 23
2.15. Morris water maze test 24
2.16. Statistical analysis 27
3. Results 28
3.1. Physicochemical characterization of AANCP 28
3.2. AANCP inhibits LPS-induced secretion of pro-inflammatory cytokines from microglia 38
3.3. AANCP stimulates microglial polarization from M1 to M2 by inducing the expression of TREM2 42
3.4. AANCP activates microglial phagocytosis in BV2 microglial cells 47
3.5. AANCP inhibits aggregation of Aβ42 50
3.6. AANCP ameliorates cognitive impairment induced by scopolamine 53
4. Discussion 63
5. Conclusion 78
Chapter II. Improvement of the Anticancer Efficacy of PD-1/PD-L1 Blockade Through Combined Treatment with AFNC and Pembrolizumab 79
1. Introduction 79
2. Materials and methods 88
2.1. Materials 88
2.2. Preparation and characterization of AFNC 88
2.2.1. AFNC's manufacturing process 88
2.2.2. AFNC preparation 89
2.2.3. Physical characterization of AFNC 89
2.3. Quantification of cyanidin-3-O-glucoside (C3G) using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 90
2.4. PD-1/PD-L1 competitive ELISA 91
2.5. Cell culture of MC38 colorectal adenocarcinoma cells 93
2.6. Humanized PD-1 mouse model 93
2.7. Tumor allograft and AFNC treatment 94
2.8. Statistical analysis 95
3. Results 97
3.1. Physicochemical characterization of AFNC 97
3.2. Pharmacokinetics of AFNC 104
3.3. AFNC blockade of the PD-1/PD-L1 interaction 107
3.4. Antitumor effect of AFNC in an MC38 tumor-bearing humanized PD-1 mouse model 109
4. Discussion 117
5. Conclusion 126
6. References 127
7. 국문초록 168