타우 단백 분비에 영향을 미치는 자가포식리소좀의 역할 연구
- 주제(키워드) 타우 단백질 , 세포외분비 , 자가포식 , 자가포식리소좀 , 알츠하이머병
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 박선아
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000034390
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
알츠하이머병은 기억력, 인지 기능, 행동에 영향을 미치는 퇴행성 신경 질환이다. 알츠하이머병의 정확한 원인은 아직 완전히 규명되지 않았으나, 베타-아밀로이드 단백질의 축적과 타우 단백질의 변형이 주요 요인으로 알려져 있다. 타우 단백질은 신경 세포의 미세소관을 안정화하는 역할을 하지만, 과도한 인산화로 인해 미세소관에서 분리되고, 이는 타우 단백질의 응집을 유도하여 신경섬유 엉킴을 형성한다. 이러한 엉킴은 자가포식에 의해 분해되지 않으며, 세포 외로 분비되어 알츠하이머병의 진행을 촉진시킨다. 이 연구에서는 타우 단백질 응집체의 분비를 억제하는 것과 자가포식간의 관련성을 알아보기 위해 자가포식 기전을 연구하였으며, 자가포식의 여러 단계 중 특히 자가포식리소좀 단계에 주목하였다. 실험에서는 Neuro-2a (N2a)세포와 N2a P301S-eGFP 세포를 사용하였고, EN6를 자가포식리소좀에 대한 활성제로, Cathepsin Inhibitor (CI), Vacuolin-1을 자가포식리소좀에 대한 억제제로 사용하여 용량 의존성을 웨스턴 블랏(Western blot)과 면역 염색(Immunocytochemistry, ICC)를 통해 확인하였다. 결과적으로, CI를 N2a 세포에 처리했을 때, 분해되지 않은 단백질의 축적에 의해 자가포식과 관련된 단백질의 축적이 용량 의존적으로 증가함을 확인하였다. N2a P301S 세포에서는 자가포식 관련 단백질의 축적에 대한 증가가 대조군과 비슷하거나 대조군에 비해 타우 단백질의 세포 내 축적 및 세포 외 분비가 증가한 경향을 보였으나 통계적으로는 유의미한 결과값이 나오지 않았다. ICC 결과에서는 lysotracker 값이 대조군에 비해 용량 의존적으로 감소하는 것이 관찰되었다. EN6에서는 N2a 세포와 N2a P301S-eGFP 세포 모두에서 일관적인 데이터나 통계적으로 유의미한 결과는 나타나지 않았다. ICC에서는 lysotracker 값이 대조군에 비해서 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며 Tau에 대한 값은 대조군에 비해서 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 자가포식리소좀의 활성화되면 비정상적인 타우를 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. Vacuolin-1을 처리했을 때는 두 세포군에서 모두 자가포식 관련 단백질의 축적이 대조군과 비슷하거나 점차 증가하는 경향이 보이긴 했지만 통계적으로는 유의미한 결과가 나오진 않았다. ICC에서는 lysotracker 값이 대조군에 비해서 용량 의존적으로 증가하는 것을 확인하였지만 Tau의 값이 감소하지는 않았다. 이것으로 자가포식리소좀이 진행된 후 외분비가 일어나지 못하면 세포 내 불필요한 단백질에 대한 분해가 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 이 연구를 통해 자가포식 과정 중 자가포식리소좀의 활성, 억제에 대한 조절이 비정상적인 타우 단백질의 분해 또는 세포 내 축적을 일으킨다는 것을 알 수 있었다.
more초록/요약
Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder that affects memory, cognitive functions, and behavior. Although the exact causes of AD remain unclear, the accumulation of beta-amyloid plaques and the pathological modification of tau protein are recognized as key contributors. Tau protein, which normally stabilizes microtubules in neurons, undergoes hyperphosphorylation, leading to its detachment from microtubules. This detachment promotes tau aggregation into neurofibrillary tangles, which are resistant to autophagic degradation and are secreted extracellularly, thereby exacerbating AD progression. In this study, we investigated the relationship between autophagy and the suppression of tau protein aggregates' secretion, focusing particularly on the autophagolysosome stage of autophagy. Neuro-2a (N2a) cells and N2a P301S-eGFP cells were used as experimental models. EN6 was employed as an activator of autophagolysosomes, while Cathepsin Inhibitor (CI) and Vacuolin-1 were used as inhibitors. Dose-dependent effects were assessed using Western blotting and immunocytochemistry (ICC). Treatment with CI in N2a cells resulted in dose-dependent accumulation of autophagy-related proteins due to the accumulation of undegraded proteins. In N2a P301S cells, autophagy-related protein accumulation trends were comparable to the control, but intracellular tau aggregation and extracellular secretion were elevated, although not statistically significant. ICC analysis revealed a dose-dependent decrease in lysotracker intensity compared to the control. For EN6, no consistent or statistically significant results were observed in both N2a and N2a P301S-eGFP cells in Western blot data. However, ICC analysis showed a dose-dependent increase in lysotracker intensity and a decrease in tau levels compared to the control, indicating that activation of autophagolysosomes can reduce pathological tau protein. Conversely, treatment with Vacuolin-1 showed a tendency for autophagy-related protein accumulation in both cell types, but without statistical significance. ICC analysis indicated a dose-dependent increase in lysotracker intensity, but no reduction in tau levels. These findings suggest that impaired extracellular secretion after autophagolysosome processing can hinder the degradation of intracellular proteins. In conclusion, this study demonstrates that regulation of autophagolysosome activation and inhibition during autophagy significantly impacts the degradation or intracellular accumulation of pathological tau protein.
more목차
I. 서론 1
II. 실험 재료 및 방법 4
A. 항체와 약물 4
B. 세포 배양 조건 4
C. 약물 처리 조건, 세포와 배지 채취 4
D. 생존 세포 수 측정 5
E. 세포 내 단백 추출 5
F. 세포 배양액 내 단백 추출 (MeOH-Chloroform precipitation) 5
G. SDS-아크릴아마이드 전기영동, 웨스턴 블롯 (Western Blot) 6
H. 면역세포염색 (Immunocytochemistry, ICC) 6
III. 결과 9
IV. 고찰 22
V. 참고 문헌 24
