Regulation of DNA-PKcs-mediated immune signaling by the E3 ligase MARCH5 in mitochondria-damaged cells
미토콘드리아 손상 세포에서 E3 연결효소 MARCH5에 의한 DNA-PKcs 매개 면역신호의 조절
- 주제(키워드) Mitochondrial DNA damage , Pattern recognition receptor , Type I interferon response , Inflammatory disorder , E3 ligase , Ubiquitination
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 이재호
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032854
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Mitochondrial DNA (mtDNA) damage impairs mitochondrial function and can lead to mitochondrial pathology and inflammation-related degenerative diseases. Damaged mtDNA is translocated to the cytoplasm and functions as a damage-associated molecular pattern (DAMP). When mtDNA present in the cytoplasm is detected by the cGAS pattern recognition receptor (PRR), it triggers a type I interferon response via the cGAS-STING signaling pathway. However, cytoplasmic DNA receptors are increasingly being identified, so I developed a system to induce mtDNA-specific double-strand breaks (DSBs) to investigate whether an alternative pathway exists to sense mtDNA in the cytoplasm. I constructed a system to induce mtDNA double-strand breaks (mtDSBs) by linking the mitochondrial transcription factors MTERF1 or TFAM, which bind specifically to mtDNA, to the cleavage domain of the FokI endonuclease and the mCherry fluorescent protein sequence to create fusion genes. When these mt-FokI endonucleases (MTERF1-FokI and TFAM-FokI) were expressed in cells, the number of mtDNA copies was significantly reduced. Interestingly, the synthesis of interferon β1 and interferon-stimulated genes (ISGs) increased in cGAS knockout (KO) cells when mtDSBs were induced. This suggested the existence of an alternative pathway induced by mtDSBs despite the absence of cGAS. Furthermore, mtDSBs were shown to activate DNA-PKcs and HSPA8. When RNA interference and pharmacological inhibition of DNA-PKcs were used to validate this mechanism, HSPA8 phosphorylation and type I interferon response were reduced. Given that DNA-PKcs is present in the cytoplasm, these results demonstrate that DNA-PKcs acts as a novel sensor to recognize cytoplasmic mtDNA derived from the formation of DSBs in mtDNA. Persistent immune signaling can lead to host immunopathology as well as cytotoxicity. Therefore, cells must turn on molecular machinery to regulate the immune balance. Interestingly, the mitochondrial E3 ligase MARCH5 bound to activated DNA-PKcs and decreased the type I interferon response by degrading DNA-PKcs in cells with mtDSBs. In RAW264.7 murine macrophages, LPS-induced mitochondrial damage increased HSPA8 phosphorylation and mIFNB1 mRNA synthesis in a DNA-PKcs-dependent manner. To investigate the role of March5 in this situation, March5 WT and KO macrophages were treated with LPS for 2-12 hours. In March5 WT cells, pHSPA8 levels peaked at 2 hours after LPS treatment and decreased over time. In March5 KO cells, the elevated pHSPA8 levels were largely maintained until the 12 hours. Similarly, in March5 WT cells, mIFNB1 mRNA levels at 8-12 hours after LPS treatment were markedly lower compared to mIFNB1 mRNA levels at 2-4 hours. In contrast, mIFNB1 mRNA levels in March5 KO cells remained largely high at 8-12 hours after LPS treatment, which is significantly different from March5 WT mIFNB1 mRNA levels at the same time point. These results demonstrate that the mitochondrial E3 ligase MARCH5 plays a role in regulating DNA-PKcs-mediated immune signaling pathways and balancing the immune response through ubiquitination and degradation of DNA-PKcs activated by induction of mtDSBs or LPS treatment. In conclusion, these findings suggest that severe mtDNA damage triggers type I interferon response through DNA-PKcs-mediated signaling in addition to cGAS signaling and that MARCH5 plays a vital role in maintaining cellular homeostasis by balancing the excessive immune response. Understanding the role of MARCH5 in the inflammatory response may provide new insights into the regulatory mechanisms of various immune diseases and impact the development of new therapies for autoimmune and neurodegenerative diseases.
more초록/요약
미토콘드리아 DNA 손상은 미토콘드리아의 기능을 손상시키고 미토콘드리아 병리 및 염증 관련 퇴행성 질환을 유발할 수 있다. 손상된 미토콘드리아 DNA는 세포질로 전위되어 손상-연관 분자 패턴 (DAMP)으로 작용한다. 세포질에 존재하는 미토콘드리아 DNA를 cGAS 패턴 인식 수용체가 감지하게 되면 cGAS-STING 신호 경로를 통해 제1형 인터페론 반응을 유발한다. 그러나, 세포질에 존재하는 DNA를 감지하는 인자들이 점차 새롭게 동정됨에 따라 본 연구에서는 미토콘드리아 DNA 특이적으로 이중가닥 절단을 유도하는 시스템을 개발하여 세포질에 존재하는 미토콘드리아 DNA를 감지하는 대체 경로가 존재하는지 조사하고자 하였다. 미토콘드리아 DNA에 특이적으로 결합하는 미토콘드리아 전사 인자인 MTERF1 또는 TFAM 서열에 FokI 엔도뉴클레이즈의 절단 도메인과 mCherry 형광단백질 서열을 연결하여 융합 유전자를 제작하여 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단을 유도할 수 있는 시스템을 구축하였다. 이러한 mt-FokI 엔도뉴클레이즈 (MTERF1-FokI 및 TFAM-FokI)를 세포 내에 발현시켰을 때, 미토콘드리아 DNA 복제본의 수가 현저히 감소하였다. 흥미롭게도, cGAS 녹아웃 세포에서 인터페론 β1과 인터페론 자극 유전자의 합성은 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단을 유도했을 때 증가하였다. 이는 cGAS가 없음에도 불구하고 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단에 의해 유도되는 대체 경로가 존재함을 시사했다. 더욱이, 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단은 DNA-PKcs 및 HSPA8을 활성화시키는 것으로 나타났다. DNA-PKcs의 RNA 간섭과 약리학적 억제를 통해 이에 대한 기전을 검증하고자 하였을 때, HSPA8의 인산화와 제1형 인터페론 반응이 감소하였다. DNA-PKcs가 세포질에 존재한다는 점을 감안할 때, 이러한 결과는 DNA-PKcs가 미토콘드리아 DNA의 이중가닥 절단 형성에서 파생된 세포질 미토콘드리아 DNA를 인식하는 새로운 센서로 작용한다는 것을 보여준다. 지속적인 면역신호는 세포독성뿐만 아니라 숙주 면역병리를 유발할 수 있기 때문에 세포는 면역반응의 균형을 조절하기 위한 분자 장치를 작동시켜야 한다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 E3 연결효소 MARCH5는 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단이 발생한 세포에서 활성화된 DNA-PKcs와 결합하여 DNA-PKcs의 분해를 통해 제1형 인터페론 반응을 감소시켰다. RAW264.7 대식세포에서 미토콘드리아 손상을 유발하는 LPS의 처리는 DNA-PKcs 의존적인 방식으로 HSPA8의 인산화와 mIFNB1 mRNA의 합성을 증가시켰다. 이러한 상황에서 MARCH5의 역할을 조사하기 위해 March5 WT 및 KO 대식세포에 LPS를 2-12시간 동안 처리하였다. March5 WT 세포에서 pHSPA8 수준은 LPS 처리 후 2시간에서 정점에 도달했고, 시간이 지남에 따라 감소하였다. March5 KO 세포에서는 증가된 pHSPA8 수준이 12시간까지 대부분 유지되었다. 마찬가지로, March5 WT 세포에 LPS를 처리한 후 8-12시간의 mIFNB1 mRNA 수준은 2-4시간의 mIFNB1 mRNA 수준에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다. 대조적으로, March5 KO 세포의 mIFNB1 mRNA 수준은 LPS를 처리한 후 8-12시간에도 대체로 높게 유지되어 같은 시점의 March5 WT 세포의 mIFNB1 mRNA 수준과 상당한 차이를 보였다. 이러한 결과는 미토콘드리아 E3 연결효소 MARCH5가 미토콘드리아 DNA 이중가닥 절단의 유도 또는 LPS 처리에 의해 활성화된 DNA-PKcs의 유비퀴틴화 및 분해를 통해 DNA-PKcs 매개의 면역신호 경로를 조절하고 면역반응의 균형을 맞추는 역할을 한다는 것을 입증한다. 결론적으로, 이러한 연구 결과는 미토콘드리아 DNA에 심각한 손상이 발생하면 cGAS 신호 이외에 DNA-PKcs 매개의 신호를 통해 제1형 인터페론 반응을 유발하고 MARCH5가 과도한 면역반응의 균형을 유지하여 세포 항상성을 유지하는데 핵심적인 역할을 한다는 것을 시사한다. 염증 반응에서 MARCH5의 역할을 이해하면 여러 면역질환의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 자가 면역 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료법 개발에 영향을 미칠 것이라 사료된다.
more목차
I. INTRODUCTUON 1
II. MATERIALS AND METHOD 9
A. Plasmids and chemicals 9
B. Cell culture 9
C. Transfection and RNA interference 9
D. Generation of March5 KO RAW264.7 10
E. Western blot analysis 10
F. Mitochondrial fractionation 12
G. Pull-down assay 12
H. Ubiquitination assay 12
I. Immunofluorescence 13
J. Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction 13
K. Mitochondrial DNA copy number assay 15
L. ATP assay 15
M. Statistical analysis 16
III. RESULTS 17
A. Establishment of FokI endonuclease systems to generate mtDNA double-strand breaks 17
B. MTERF1-FokI-mCherry and TFAM-FokI-mCherry localize to mitochondria 19
C. Fluorescence signal of the mtDNA is reduced in an activity-dependent manner at the mt-FokI endonuclease 21
D. Specific targeting of mtDNA by the FokI endonuclease reduces the amount of mtDNA 23
E. Mt-FokIs do not affect nuclear DNA damage response and ATP synthesis upon mtDNA degradation 26
F. A type I interferon response is triggered by mtDSBs even in the absence of cGAS 29
G. Mitochondrial DNA cleavage increases phosphorylation of IRF3 and HSPA8 in a variety of cell lines 32
H. DNA-PKcs mediates phosphorylation of HSPA8 and IRF3 in response to breaks in mtDNA 34
I. Cleaved mtDNA elicits DNA PKcs-mediated type I interferon response via the VDAC macropore 37
J. Mitochondrial E3 ligase MARCH5 degrades DNA-PKcs in a proteasome-dependent manner 40
K. MARCH5 binds and ubiquitylates activated DNA-PKcs 43
L. MARCH5 suppresses DNA-PKcs-mediated type I interferon response 46
M. LPS treatment elicits DNA-PKcs-dependent type I interferon response in murine macrophages 48
N. MARCH5 prevents prolonged type І Interferon response in murine macrophage stimulated by LPS 51
IV. DISCUSSION 54
REFERENCE 57
국문요약 64
