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재조합 섬유성 알파 시누클레인을 이용한 세포내 응집체 모델 시스템 구축

Generation of in vitro model system using recombinant α-synuclein fibrils

  • 김범진 (아주대학교 일반대학원)

초록/요약

파킨슨병은 중뇌의 흑질치밀부(Substantia nigra pars compacta)에서 도파민성 신경세포의 점진적인 소실을 특징으로 하는 질병이다. 이러한 파킨슨병의 특징은 루이 소체(Lewy body, LB) 및 루이 신경돌기(Lewy neurites, LN)이라고 알려진 응집체가 존재하며, 이러한 응집체를 구성하는 주요 구성요소는 알파-시누클레인(α-synuclein)이라고 알려져 있다. 많은 보고와 결과들은 알파-시누클레인으로 구성된 응집체들이 인접한 신경 세포에 전파되어 파킨슨병의 진행을 초래하는 것을 나타낸다. 고속 대량 약물 스크리닝을 위한 세포 내 모델 시스템을 개발하기 위해, 우리는 A53T-α-syn-EGFP를 발현하는 안정적인 세포주를 생성하고, 미리 형성된 재조합 α-syn 섬유(PFF)를 용량 및 시간별로 처리했다. 확인한 결과 용량 및 시간 의존적 방식으로 PFF를 처리하여 A53T-α-syn-EGFP 응집체의 형성을 관찰했다. 형성된 응집체를 세포당 응집체의 수, 응집체의 평균 크기, 응집체의 평균 형광 세기, 응집체를 가지는 세포의 비율 등 다양한 방법으로 응집체를 분석하였다. 세포당 응집체의 수와 응집체를 가지는 세포의 비율은 낮은 농도의 PFF에서 증가한 반면, 응집체의 평균 크기와 평균 형광 세기는 높은 농도의 PFF에서 증가했다. PFF 처리된 A53T-α-syn-EGFP 세포에 pSer129 알파-시누클레인 항체를 염색했을 때, 모든 응집체가 pSer129 알파-시누클레인 항체로 염색되지는 않았다. A53T-α-syn-EGFP의 응집체와 pSer129 알파-시누클레인의 공동 국소화는 시간 의존적 방식으로 증가하고, 초기 응집 후 pSer129 알파-시누클레인이 발생함을 확인하였다. 또한, 자가포식기전을 억제했을 때, 응집체가 증가하는 것을 확인했고, 활성시켰을 때, 응집체가 감소하는 것을 확인하였다. 알파-시누클레인의 전파를 억제한다고 보고한 c-src 유전자를 넉다운 시켰을 때와 c-src 억제제인 사라카티닙을 사용했을 때, 응집체의 형성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 것을 바탕으로 이 모델 시스템은 짧은 시간에 알파-시누클레인 응집체의 형성을 모니터링하고 고속 대량 약물 스크리닝으로 사용하는데 도움이 될 것이다.

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초록/요약

Parkinson's disease is a disease characterized by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta of the midbrain. The characterization of Parkinson’s disease (PD) is the presence of α-synuclein (α -syn) inclusions called Lewy bodies (LBs) or Lewy neurites (LNs). Gathering evidence indicates that α-syn inclusions propagate to neighboring neurons, resulting in the progression of PD. To develop an in vitro model system for high throughput drug screening, we generated a stable cell line expressing A53T-α-syn-EGFP and treated it with preformed recombinant α-synuclein fibrils (PFF). We observed the formation of A53T-α-syn-EGFP inclusions by the treatment with PFF, but not monomers in dose- and time-dependent manners. We analyzed various parameters of aggregation puncta such as the number of dots per cell, size of dots, intensity of dots, and percentage of cells containing aggregation puncta. The number of dots per cell and percentage of cells containing aggregation puncta increased from lower concentrations of PFF, while the size of dots and intensity of dots increased in higher concentrations of PFF. When we costained PFF-treated A53T-α-syn-EGFP cells with pSer129 α-syn antibody, not all aggregation puncta were not stained with pSer129 α-syn antibody. It was confirmed that the co-localization of the aggregation puncta of A53T-α -syn-EGFP and pSer129 α-syn increased in a timedependent manner, resulting in pSer129 α-syn after initial protein aggregation. In addition, when the autophagy mechanism was suppressed, it was confirmed that the aggregation puncta increased, and when activated, the aggregation puncta decreased. When the c-src gene that reported inhibiting α-syn propagation was knocked down and the c-src inhibitor saracatinib was used, it was found that the formation of aggregation puncta decreased. This model system will be helpful to monitor the formation of α-syn inclusions in a short time and use it for high throughput drug screening.

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목차

Ⅰ 서론 1
A. 파킨슨병 1
B. 알파-시누클레인(α-synuclein) 3
C. 파킨슨병에서 알파-시누클레인의 프리온 유사 전파 5
D. 알파-시누클레인의 프리온 유사 전파를 이용한 모델 시스템 6
E. 실험 목적 10
Ⅱ 재료 및 실험 방법 12
A. 시약 및 항체 12
B. 세포배양 13
C. 외인성 PFF 처리 13
D. 공초점레이저주사현미경 14
E. 이미징 분석 15
F. Western blot 15
G. 통계분석 16
Ⅲ 결과 17
A. A53T-α-syn-EGFP가 과발현되어 있는 세포에 외인성 PFF 첨가했을 때, 시간 그리고 농도 의존적으로 응집된 점들이 생성된다 17
B. A53T-EGFP의 응집된 점은 PFF특이적이며, 알파-시누클레인 species 특이적이며, 세포의 종에 따라 응집되고 형성된 점의 양상이 달라진다 24
C. A53T-EGFP 응집체는 시간 의존적인 방식으로 pSer129 알파-시누클레인을 포함한다 29
D. 약리학적, 유전적 변형은 외인성 PFF에 의해 유도된 A53T-EGFP의 응집체 형성을 변화시켰다 33
Ⅳ 고찰 40
Ⅴ 결론 53
참고문헌 54
Abstract 69

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