Structural study on the potential anti-cancer target proteins, Cobll1 and CCSP-2
- 주제(키워드) Chronic myeloid leukemia , Cobll1 , Colorectal cancer , CCSP-2 , scFv
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 서민덕
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032743
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematopoietic malignancy driven by chromosomal abnormalities. Drug resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and progress of the disease to blast crisis (BC) are major obstacles in clinical trials for CML. Cobll1 protein was suggested as a novel molecular marker associated with TKI resistance along with progression to BC. PACSIN2 protein which activates TKI-mediated apoptosis is repressed by Cobll1 through direct SH3:proline-rich motif interaction. In addition, SH3BP1 which activates Rac1 pathway is released from PACSIN2 by competitive interaction of Cobll1. To examine the interactions between SH3 domain and two proteins, we employed NMR spectroscopy using proline-rich peptides of Cobll1 (Cobll1-PRPs). In NMR experiments, we found that NMR spectra of PACSIN2-SH3 were gradually shifted by three kinds of Cobll1-PRP in a concentration dependent manner. With structure prediction and docking model, we could confirm that the three Cobll1-PRPs lie on the same hydrophobic groove located on the surface of PACSIN2-SH3. As PACSIN2-SH3 could bind to Cobll1-PRMs and SH3BP1-PRMs either, we evaluated the binding affinity by using SPR and NMR spectroscopy. PACSIN2-SH3 exhibited significantly higher binding affinity for the Cobll1-N (25.8 nM of Kd) than for the C-terminus region of SH3BP1 (SH3BP1-C) (2.2 µM of Kd). In NMR titration assay, it was revealed that the overall conformation change of PACSIN2-SH3 upon Cobll1-N or SH3BP1-C binding were similar. In NMR replacement titration, it was further demonstrated that PACSIN2-SH3 bound preferentially to Cobll1-N than SH3BP1-C consistent with SPR data. Collectively, our studies would contribute to understanding molecular binding mechanism among PACSIN2, Cobll1, and SH3BP1 which lead to TKI resistance and rapid progression to BC in CML. Colorectal cancer (CRC) is one of the most lethal and concurrently prevalent tumors which arise from colonic and rectal epithelial tissues. Despite of the advancement of numerous diagnosis methods and therapeutics, approximately 25% of total CRC patients are diagnosed at late stage with metastasis and have difficulties in recovering completely. Colon cancer secreted protein-2 (CCSP-2) was identified novel serum marker of CRC as putative candidate for diagnosis and targeted therapy for CRC. CCSP-2 protein is expressed in colorectal tissues in high degree and secreted into the blood. In this study, we characterized anti-CCSP-2 antibodies which target EGF-like domain 2 (E2 domain) of CCSP-2. Single-chain variable fragments (scFv) version of antibodies (scFv 19 and scFv 20) were produced in E. coli expression system and purified in maltose binding protein (MBP)-fused form for high solubilization. In ITC binding assay, the two types of scFv were titrated with V3E2 or E2 domain of CCSP-2 and showed different binding affinities, respectively. The crystal structures of scFv 20 alone, scFv 20:V3E2 domain complex, and scFv 19:E2 domain-based peptide complex were determined. The interface regions and residues involved in interaction of CCSP-2:scFv complex were analyzed in molecular level. Here, we propose the binding mechanism that antibodies targeting CCSP-2 which are upregulated in CRC. Furthermore, the present results would provide structural insights into CCSP-2:antibodies complex that will help therapeutic applications.
more초록/요약
만성 골수성백혈병 (CML)은 필라델피아 염색체에 의해 발생하는 악성 혈액 종양 질환이다. 타이로신카이네이즈 억제제 (TKI) 저항성과 급성기로의 진행 은 만성 골수성백혈병 임상치료의 주된 저해요인이다. Cobll1 단백질은 타이로 신카이네이즈 억제제 저항성과 급성기 진행의 신규 바이오 마커로 발견되었으 며, PACSIN2 단백질과 SH3BP1 단백질이 이 메커니즘에 관여하는 것으로 밝 혀졌다. PACSIN2 단백질은 세포사멸을 촉진하는 것과 달리, SH3BP1 단백질 은 Rac1 신호 전달 체계를 활성화하여 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있 다. 과발현된 Cobll1 단백질이 PACSIN2 단백질과 SH3BP1 단백질의 결합을 경쟁적으로 저해하여 SH3BP1 단백질을 유리시키고, 유리된 SH3BP1 단백질 에 의해 세포사멸이 억제됨으로써 타이로신카이네이즈 억제제 저항성과 급성기 진행이 유발된다. 본 연구는 Cobll1, PACSIN2, 그리고 SH3BP1 단백질의 결 합 상관관계 연구를 구조적 관점에서 진행하였다. PACSIN2 단백질의 SH3 도 메인과 Cobll1 단백질의 proline-rich 모티프 간의 상호 작용을 이해하기 위 해 핵 자기 공명 (NMR) 분광법을 사용하였다. NMR 결과에 따르면, Cobll1 안 에 존재하는 세 종류의 proline-rich 모티프들의 PACSIN2 단백질 SH3 도메 인에 대한 결합모드는 유사하였다. 3차원 구조 분석을 위해 결정화 (crystallization)를 진행하였으며, 구조 예측과 모델링을 통하여 PACSIN2 단 백질 SH3 도메인과 Cobll1 단백질의 proline-rich 모티프의 결합면에 관여하 는 잔기들을 분석할 수 있었다. Cobll1 단백질과 SH3BP1 단백질의 PACSIN2 단백질에 대한 경쟁적 결합을 증명하기 위해 표면 플라즈몬 공명 (SPR)과 NMR을 이용하였다. 그 결과, Cobll1 단백질은 SH3BP1 단백질에 비해 약 85 배 큰 결합세기로 PACSIN2 단백질과 결합하였으며, 세 종류의 단백질이 모두 존재하였을 때 PACSIN2 단백질은 Cobll1 단백질과 더 우선적으로 결합하는 것을 증명하였다. 본 연구를 통해 Cobll1, PACSIN2, SH3BP1 단백질의 결합 상관 관계를 규명하였으며, Cobll1 단백질의 존재가 PACSIN2 단백질로부터 SH3BP1 단백질을 방출시키고 CML 세포의 세포사멸에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 직대장암 (CRC)은 직장과 대장의 상피세포에서 발생하는 종양으로 조기 진단 과 효과적인 치료를 위해 신규 바이오 마커 개발이 필요한 상황이다. CCSP-2 단백질은 직대장암 세포에서 과발현되며, 혈액으로 분비되는 것이 밝혀졌다. 또 한, 세포외기질에 존재하는 물질들이 대직장암을 포함하여 상피세포 유래 암세 포의 증식과 이동에 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 본 연구에서는 직대장암 에서 과발현된 CCSP-2 단백질이 세포 외로 분비되는 바이오 마커를 타겟하 기 위한 항체를 개발하였다. CCSP-2 단백질의 EGF-like 2 도메인을 타겟하 는 두 종류의 scFv 형태의 항체를 말토오즈 결합 단백질과 융합하였으며 E. coli 발현 시스템을 통해 생산하였다. 두 종류의 scFv 항체의 CCSP-2 단백질 에 대한 결합 친화력을 ITC를 통해 측정, 비교하였다. X-선 회절을 통한 구조 연구를 위하여, scFv 항체와 EGF-like 2 도메인을 포함한 C-말단 영역의 CCSP-2 단백질을 각각 정제 후 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 결합 형태의 단백질을 분리하였다. scFv와 CCSP-2 결합 단백질을 결정화에 성공하 였으며, 1.9Å 해상도의 결합구조를 규명하였다. 결합단면 분석을 통하여 결합 에 관여하는 scFv 항체와 CCSP-2 단백질의 잔기들을 특정할 수 있었다. 또 한, scFv 항체와 CCSP-2의 항원결정기에 해당하는 펩타이드의 결정화에 성공 하였으며 2.5 옴스트롱 해상도의 결합구조를 규명하였다. 본 연구를 통해, CCSP-2와 항체의 결합 구조 정보를 활용하여 항체의 엔지니어링에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, CCSP-2 단백질과 세포외 기질에서의 역할에 대한 추가적인 연구가 필요하겠지만 직대장암의 진행과 전이에 대한 억제 메커 니즘을 밝혀내는 데 기여할 수 있을 것이다.
more목차
General Introduction 1
Chronic myeloid leukemia 1
Cobll1, PACSIN2 and SH3BP1 5
Interaction between SH3 domain and proline-rich motif 6
Purpose of this study 8
Colorectal cancer 9
Colon cancer secreted protein-2 (CCSP-2) 11
Extracellular matrix 12
Antibody 14
Purpose of this study 15
Chapter 1 16
1.1 Introduction 16
1.2 Experimental Procedures 17
1.2.1 Protein expression and purification 17
1.2.2 Peptide 18
1.2.3 Surface plasmon resonance (SPR) 18
1.2.4 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 18
1.2.5 Crystallization 19
1.2.6 Multiple angle light scattering (MALS) 20
1.2.7 MALDI-TOF 20
1.3 Results 22
1.3.1 Expression and purification of PACSIN2-SH3 22
1.3.2 Preparation of three Cobll1-PRPs 25
1.3.3 NMR backbone assignments of PACSIN2-SH3 27
1.3.4 NMR titration study of PACSIN2-SH3 with the three Cobll1-PRPs 30
1.3.5 Crystallization of PACSIN2-SH3 with proline-rich peptides of Cobll1 35
1.3.6 Structure prediction and docking model of PACSIN2-SH3 with proline-rich peptides 38
1.3.7 HSQC spectroscopy spectra of PACSIN2-SH3 in the presence of Cobll1-N and SH3BP1-C 43
1.3.8 Differential binding affinity of Cobll1 and SH3BP1 for PACSIN2-SH3 48
1.3.9 Competitive binding of Cobll1 and SH3BP1 to PACSIN2-SH3 50
1.4 Discussion 53
Chapter 2 56
2-1 Introduction 56
2.2 Experimental Procedures 58
2.2.1 Construct design, expression, and purification of CCSP-2 58
2.2.2 Peptide 60
2.2.3 Construct design, expression, and purification of scFvs 60
2.2.4 Isothermal titration calorimetry (ITC) 60
2.2.5 Crystallization and data collection 61
2.2.6 Structure determination and refinement 61
2.3 Results 63
2.3.1 Expression and purification of C-terminus region of CCSP-2 63
2.3.2 Expression and purification of scFv 66
2.3.3 Binding affinities between CCSP-2 and scFv 69
2.3.4 Crystallization of apo-scFv 20 72
2.3.5 Crystallization of scFv 20:V3E2 complex 74
2.3.6 Crystallization of scFv 19:peptide 6 complex 78
2.3.7 Superimposition structure of scFv 19:peptide 6 complex and scFv 20:V3E2 complex 81
2.4 Discussion 83
Conclusion 85
References 86
