Development and application of transcription factors TFEB/TFE3 activity assay system in cancer
- 주제(키워드) Transcription factor , TFEB , TFE3 , lysosome , LKB1 , pH
- 주제(DDC) 615.1
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 전상민
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032710
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Cancer cells survive in various metabolic and oxidative stress condition. In previous study AMPK/LKB1 activated in nutrient depletion condition, and NRF2 activated by toxin accumulation condition. In previous study between AMPK/LKB1 and NRF2 interaction, NRF2 was activated by regulating TFEB/TFE3 expression by AMPK/LKB1. Therefore, we found TFEB/TFE3 is an important regulator, but there is no drugs targeting TFEB/TFE3. So we established various TFEB/TFE3 assay system to measure activity to use in the drugs screening. Transcriptional factor EB/E3 (TFEB/TFE3) is a master regulator of lysosome biogenesis. At first, we checked TFEB/TFE3 affected in lung cancer, and confirmed that there was an anticancer effect during TFEB/TFE3 double knock down. CLEAR motif Luciferase system was established to measure activity of TFEB/TFE3, and it might be used for inhibitor screening in future. Based on previous studies, TFEB/TFE3 activity was affected by lysosomal stress, lysosomal acidity system was established to measure lysosomal stress in real time. This can be used to elucidate the role of TFEB/TFE3 in lysosome stress in future. Then, when the correlation between LKB1 and TFEB/TFE3 was checked, it was found that LKB1 activates TFEB/TFE3 via PP2A. Also, it was confirmed that LKB1 regulates the activation of TFEB/TFE3 by pH. By confirming with the lysosome and cytosol pH system, LKB1 was required for maintaining lysosome and cytosol pH. Based on this, we thought that LKB1 affects v-ATPase, a type of lysosome pump that delivers hydrogen ions through the regulation of TFEB/TFE3 expression.
more초록/요약
암의 다양한 대사스트레스와, 환경스트레스에서 암세포는 살아 남게 되는데, 선행연구에 의하면 이때 영양소가 결핍 되어 있을 경우에는 AMPK/LKB1 이 활성화 되고, 독성물질이 축적되어 있을 경우 NRF2 가 활성화된다. 이들의 상호작용에 관해 연구 진행 결과 AMPK/LKB1 에 의해 TFEB/TFE3 발현을 조절하여 NRF2 가 활성화 됨을 알게 되었다. 따라서 우리는 TFEB/TFE3 가 중요한 조절자 임을 알았지만, 현재까지 TFEB/TFE3 를 억제하는 약물이 존재 하지 않다. 이에 TFEB/TFE3 에 대한 약물을 스크리닝 할 때 사용할 수 있는 다양한 TFEB/TFE3 활성도를 측정할 수 있는 시스템을 확립 했다. TFEB/TFE3(Transcriptional factor EB/E3)는 전사인자로서 리소좀 생합성을 조절하는 대표적인 조절 전사 인자 이다. 우선 TFEB/TFE3 에 의해 폐암 세포에 영향이 있는지 확인을 하였고, TFEB/TFE3 동시 발현억제시 항암 효과가 있음을 확인하였다. 그후 CLEAR motif luciferase system 을 확립하여 TFEB/TFE3 의 활성을 측정할 수 있게 하였고, 이러한 시스템을 통해 추후에 억제제 스크리닝에 사용될 수 있을 것이라 생각 한다. 리소좀 스트레스에 의해 TFEB/TFE3 가 영향을 받기 때문에, 리소좀 스트레스를 실시간으로 측정 할 수 있는 리소좀 산성도 시스템을 구축 하였다. 이 또한 추후에 리소좀 스트레스 에서 TFEB/TFE3 의 상관관계를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 시스템을 사용하여 AMPK/LKB1 과 TFEB/TFE3 의 상관관계를 확인 하였을 때, LKB1 이 PP2A 통해서 TFEB/TFE3 를 활성화 시킨다는 사실을 알았다. 또한 세포의 산성도에 의해서도 TFEB/TFE3 가 조절됨을 확인했다. 실시간 리소좀과 세포질 산성도를 측정하는 시스템에 의해 확인을 한 결과, LKB1 이 있을 때 리소좀과 세포질 산성이 유지 되는 반면 LKB1 이 돌연변이 되어있을 경우 리소좀과 세포질 산성이 유지 되지 않음을 확인 했다. 따라서 LKB1 이 TFEB/TFE3 발현 조절을 통해 수소이온을 전달하는 수소이온 이동 펌프에 작용하여 리소좀과 세포질 산성도 유지에 필요로 함을 확인 했다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II.MATERIALS AND METHODS 4
III. RESULTS 8
A. TFEB/TFE3 knock down effects on cancer cell grwoth 8
B. Established CLEAR Luciferase system to measure transcriptional factor TFEB/TFE3 10
C. Monitoring lysosomal pH and cytosol pH in live 13
D. LKB1 regulates TFEB/TFE3 activity by PP2A and pH 18
E. LKB1 effects on lysosome v-ATPase pump to move hydrogen ion 22
IV. DISCUSSION AND CONCLUSION 25
V. REFERENCE 27
국문요약 31
