Annexins play essential roles in the biogenesis of apoptotic exosomes
세포고사 엑소좀에서 Annexin의 역할과 중요성
- 주제(키워드) Exosome , Exosomes , Annexnin
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 최용준
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032652
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
세포 간 통신을 매개하는 엑소좀은 대개 살아있거나 스트레스를 받는 세포에서 발견되어 연구되었지만, 최근 세포고사 (apoptosis)로 죽어가는 세포에서 기원하는 엑소좀이 주목을 받고 있다. 세포고사유래 엑소좀 (apoptotic cell-derived-exosomes; ApoExos)은 염증, 자가면역 반응, 암세포 증식, 세포 생존 등 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려졌다. 최근 선행 연구에 따르면, 아직 잘 알려지지 않은 강 내막 소포 (Intraluminal vesicles, ILVs)의 형성 과정 중에서, Gasdermin E에 의해 생성된 엔도솜 (endosome)의 기공을 통하여 Ca2+ 이온이 유입되고 세포질 내의 Ca2+ 농도가 국소적으로 증가할 가능성을 밝혔다. 이를 토대로 본 연구에서는 ILVs 형성에 주요한 역할을 하는 endosomal sorting complex required for transport-III (ESCRT-III complex)복합체와 칼슘 결합 단백질, annexins이 ApoExos의 합성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 먼저 ApoExos에 Annexins이 존재하는지를 알아본 결과, ApoExos의 표지 단백질과 함께 풍부하게 위치하는 것을 관찰하였다. 그중에서도 ESCRT-III 복합체와 관련이 있다고 보고된 Annexin A2및 Annexin A7의 유전자를 제거하였을 때, ApoExos의 합성이 억제되는 것을 관찰하였다. 또한, 세포고사시에 Gasdermin E와 Annexins이 다소포체 (Multivesicular bodies, MVBs)를 포함하는 세포 내 엔도솜 막에 같이 위치하고 상호작용한다는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 결과를 통해 Annexins이 ApoExos의 합성 과정에 스캐폴드 단백질(scaffold protein)으로 작용할 가능성을 제시한다.
more초록/요약
Exosomes are commonly found in both normal and stressed cells, but the ones originating from dying cells have recently attracted attention. Apoptotic cell-derived Exosomes (apoptotic exosomes: ApoExos) are known to perform various functions such as inflammation, autoimmune reactions, cell proliferation, and survival. In a previous study, it has been reported that an increase of cytosolic Ca2+ through endosomal pores produced by Gasdermin E affected the biogenesis of the ApoExos. In this study, I investigated the role of annexins, known as calcium/phospholipid-binding protein, in the formation of the intraluminal vesicles (ILVs), which are not yet well known. Because annexins are previously known to be associated with recruitment of ESCRT-III complex (Endosomal sorting complex required for transport-III) and formation of endosomes in plasma membrane repair. Therefore, I tested the role of calcium binding protein, annexins, on the synthesis of ApoExos as well as the potential to interact with the ESCRT-III complex involved ILVs formation. As a result, we confirmed the existence of annexins on ApoExos and revealed the inhibition effect on the release of ApoExos through the knock-out of annexin A2 and annexin A7, belonging to a family of annexins. Also, we observed that annexins were co-localized and interacted with Gasdermin E and ESCRT-III complex which mediated the biogenesis of ILVs. Through these results, I suggest that annexins act as a scaffold protein in the synthesis of ApoExos and contribute to the formation of a multivesicular body (MVB).
more목차
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 5
A. 세포, 항체 및 시약 5
B. 세포 용해물 (cell lysates) 준비와 웨스턴 블랏 (Western Blot) 5
C. 재조합 플라스미드와 크리스퍼 유전자 가위 시스템 (CRISPR/Cas9 system) 6
D. 엑소좀의 분리와 밀도차등원심분리 (Density Gradient Ultracentrifugation) 7
E. 면역침강법 (Immunoprecipitation) 7
F. 나노 입자 추적 분석법 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) 7
G. 세포분획법 (Subcellular Fractionation) 7
H. 공초점 현미경 분석 (Confocal Microscopy) 8
I. 통계적 분석 (Statistical Analyses) 8
Ⅲ. 결과 9
A. Apoptotic esoxomes에 존제하는 Gasdermin E와 Annexins. 9
B. Apoptotic esoxomes에 존제하는 Gasdermin E 합성에 관여하는 Annexins. 11
C. Apoptotic esoxomes에 존제하는 Gasdermin E 합성에 관여하는 Annexins. 13
D. 세포고사에서 함께 위치하는 Gasdermin E와 Annexins. 15
E. Apoptotic esoxomes의 생합성에 참여하는 Annexins. 17
F. Gasdermin E와 칼슘 결합 단백질들의 세포 내 구획 분석. 19
Ⅳ. 고찰 (DISCUSSION) 22
Ⅴ. 결론 (CONCLUSION) 23
Ⅵ. 참고문헌 (REFERENCES) 24
