Mechanisms of ischemic white matter injury in renovascular hypertensive rats and development of therapeutic targets
- 주제(키워드) Blood-brain barrier , White matter , Oligodendrocyte
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김병곤
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032551
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
The subcortical white matter is composed of axons and myelin sheaths that wrap around the axons, with a physiological role of rapid conduction of electrical signals. Chronic impairment of cerebral blood flow due to vascular risk factors such as hypertension underlies white matter degeneration in the elderly, which is a pathological hallmark in subcortical ischemic vascular dementia. Potential mechanisms of how ischemic stresses lead to demyelination and axonal degeneration in the white matter are largely unknown. Accordingly, there is no therapeutic option to prevent or delay ischemic white matter degeneration. A lack of an optimal animal model, especially one with unequivocal and replicable ischemic subcortical white matter lesions would be a great hurdle to breakthrough research outcomes in this field. Therefore, I aimed to establish an animal model exhibiting obvious white matter degeneration by experimentally inducing renovascular hypertension (RVH) in rats. With this novel animal model available, I also sought to elucidate mechanisms that trigger the white matter pathology, especially focusing on disruption of the blood brain barrier (BBB). Finally, I employed a single cell RNA sequencing technology to identify specific glial cell subtypes that play a critical role in the white matter degeneration leveraging the unequivocal white matter pathology in this model. In the first part of the thesis, I sought to establish an animal model that could mimic human white matter injury more closely and that could produce well-defined pathological changes in the white matter. I observed distinct white matter pathologies in rats with RVH induced by a two-kidney, two-clip (2K2C) procedure. In this model, we detected a marked reduction in myelin basic protein and axonal degeneration within the corpus callosum and the cingulum. These white matter pathologies were accompanied by white matter hyperintensities on T2 MRI and a decrease in the fractional anisotropy value in diffusion tensor imaging. A substantial extent of mature oligodendrocyte (OL) loss was evident accompanied by an increased number of immature OLs, reactive astrogliosis, and microglial activation. Furthermore, we found that tau aggregation can occur in degenerating white matter. Having established the RVH-induced white matter degeneration model, I aimed to identify pathological mechanisms of white matter injury, particularly the potential effects of the Angiotensin II (Ang II) on the BBB in the second part of the thesis. The deposition of fibrinogen and IgG extravasation in the subcortical white matter indicated increased permeability of the BBB during the pathological progression of the white matter damage. Consistent with these findings, an endothelial tight junction protein ZO-1 showed a progressive decline in this model. Ang II, the main hormone responsible for RVH, was significantly elevated in the plasma and more so in the cerebrospinal fluid. Direct application of Ang II to cultured brain endothelial cells induced endothelial reactive oxygen species in vitro. Intracerebroventricular infusion of losartan, an Ang II receptor blocker, significantly attenuated the white matter degeneration and neurological deficits in the 2K2C RVH model without affecting systemic hypertension. These results suggest that elevation of brain Ang II level in RVH may be responsible for the disruption of BBB tight junctions and thereby trigger subcortical white matter degeneration. Potent inhibition of endothelial Ang II receptors within the brain may slow the progression of subcortical white matter degeneration, ultimately preventing vascular dementia in hypertensive elderly. In the third part of the thesis, I profiled transcriptomic changes at an individual cellular level utilizing the RVH white matter injury model I established in this thesis research. Single cell RNA-seq revealed that RVH-induced white matter injury increased the expression of genes related to neurodegeneration while decreasing genes with homeostatic functions in microglial cells. The Spp1 gene was the most robustly upregulated in microglial cells in RVH-induced white matter degeneration, suggesting that Spp1+ microglial cells may orchestrate neurodegeneration-like pathological processes. The innate immune pathway was robustly enriched in oligodendrocytes in RVH-induced white matter injury. This pathway may afford protective and/or reparative functions to oligodendrocytes and myelin. Analyzing glial cell type-specific transcriptomic landscape during the ischemic white matter changes may lead to the identification of potential molecular targets that could be exploited for the development of novel therapeutic strategies. In conclusion, my thesis research successfully established an ischemic white matter injury model with unequivocal and replicable white matter pathologies induced by RVH. I demonstrated that elevated Ang II within the brain can trigger endothelial damage and BBB disruption in this model, ultimately leading to white matter degeneration. Single-cell RNA-seq identified microglial cells with upregulation of neurodegeneration-related genes as a potential target to halt or delay the degenerative process in the white matter.
more초록/요약
피질하 백질은 축삭돌기와 축삭돌기를 감싸는 수초로 구성되어 있으며 신호의 빠른 전도라는 생리학적 역할을 한다. 고혈압과 같은 혈관 위험 인자로 인한 뇌 혈류의 만성 장애는 피질하 허혈성 혈관성 치매의 병리학적 특징인 노인의 백질 변성의 기초가 된다. 만성 허혈이 어떻게 백질의 탈수초화 및 축삭 변성을 유발하는지에 대한 잠재적 기전은 거의 알려져 있지 않고, 허혈성 백질 변성을 예방하거나 지연시키는 특효 치료 방법은 없다. 때문에 그 기전을 분석하기 위하여 연구자들은 최적의 동물 모델, 특히 사람의 백질 변성과 비슷한 허혈성 피질하 백질 병변이 있는 모델이 필요하다. 따라서 본 연구의 첫번째 부분에서는 명확한 백질 변성을 나타내는 동물 모델을 확립하는 것을 연구목표로 하였다. 또한 새로운 동물 모델로 특히 혈액뇌장벽의 파괴에 초점을 맞춰 백질 병리를 유발하는 기전을 밝히고, 진일보호 단일 세포 RNA 시퀀싱 기술을 사용하여 백질 병리에서 중요한 역학을 하는 신경세포들의 기전을 식별하고자 하였다. 연구의 첫 번째 부분에서 사람의 백질 손상을 더 잘 재현할 수 있고 병리학적 변화를 관찰할 수 있는 동물 모델을 확립하려고 하였다. 두개의 신장동맥에 클립을 클립 (2 kidney, 2 clip) 하여 유도된 신혈관성 고혈압 (Renovascular hypertension, RVH) 쥐에서 병리학적 변화를 관찰했다. 이 모델의 백질 내에서 수초 및 축삭의 현저한 감소를 관찰할 수 있었다. 이러한 백질 병리학은 자기공명영상 (MRI)에서 뇌 백질변성 (White matter hyperintensities)으로 확인되었고 확산 텐서 영상(DTI)에서 분획 이방성 (fractional anisotropy) 값의 감소를 동반했다. 상당한 정도의 성숙한 희소돌기아교세포 (mature oligodendrocytes)는 감소하였고 희소돌기 신경교세포의 전구세포 (oligodendrocyte progenitor cells)는 증가하였고, 성상세포 (astrocytes) 및 소교세포 (microglia)의 활성화를 관찰하였다. 또한 백질 변성 부위에서 타우단백 (tau protein)의 응집이 발생할 수 있음을 확인했다. 연구의 두 번째 부분에서는 백질 손상의 병리학적 메커니즘, 특히 혈액뇌장벽에 대한 Angiotensin II (Ang II)의 잠재적 영향을 확인하는 것을 목표로 했다. 피질하 백질에서 섬유소원 (fibrinogen) 및 면역글로불린 G (IgG)의 혈관외유출의 침착은 백질 손상의 병리학적 진행 동안 혈액뇌장벽의 투과성이 증가함을 나타낸다. 이러한 발견과 일치하게, 혈관 내피 밀착 연접 단백질 zona occludens-1 (ZO-1)은 감소하였다. RVH를 담당하는 주요 호르몬인 Ang II는 혈장과 뇌척수액에서 상당히 증가됨을 알 수 있었다. 시험관 내에서 배양된 뇌 내피 세포에 Ang II를 직접 처리하면 반응성 산소 종 (reactive oxygen species)이 유도되었다. Ang II 수용체 차단제인 로자탄 (losartan)의 뇌실 내 주입은 고혈압에 영향을 미치지 않으면서 RVH모델에서 백질 변성을 유의하게 약화시켰다. 이러한 결과는 뇌 Ang II의 상승이 BBB 밀착 연접의 파괴에 원인이 될 수 있으며 따라서 피질 하 백질 변성을 유발할 수 있음을 시사한다. 뇌 혈관 내피세포 Ang II 수용체의 강력한 억제는 피질 하 백질 변성의 진행을 늦추어 궁극적으로 고혈압 노인의 혈관성 치매를 예방할 수 있다. 연구의 세번째 부분에서는 RVH 백질 손상 모델에서 단일 세포 유전자 분석을 통하여 서로 다른 세포들의 상호작용과 조직의 기능을 연구하고자 하였다. 이 연구 부분의 결과는 Spp1+ 소교세포가 백질 변성 유사 병리학적 과정에서 중요한 역할을 할 수 있으며 희소돌기아교세포의 선천적 면역 경로가 RVH로 유발된 백질 손상의 보호 및/또는 회복 메커니즘에 연루될 수 있음을 시사했다. 이러한 허혈성 백질 변성 과정 중 각각 세포 유형별 전사체를 분석함으로써 새로운 치료 전략 개발에 활용될 수 있는 잠재적인 분자 타겟을 식별할 수 있을 것이라 생각된다. 본 연구는 RVH 동물모델에서 명확하고 재현 가능한 백질 병리를 가진 허혈성 백질 손상 모델을 확립했다. 또한 이 모델에서 Ang II가 내피 손상 및 BBB 파괴를 유발하여 궁극적으로 백질 퇴화로 이어질 수 있음을 입증했다. 단일 세포 RNA-seq분석을 통하여 미세아교세포는 백질의 퇴행성 과정을 중단하거나 지연시키는 잠재적인 표적으로 작용함을 확인하였다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
A. The importance of subcortical white matter injury research 1
B. Animal models of the subcortical ischemic white matter injury 3
1. Animal model induced by vasoconstrictors 4
2. Animal model of chronic cerebrovascular occlusion 5
3. Animal model carrying comorbid vascular risk factors 6
C. Role of BBB integrity in hypertension 8
D. Linking between BBB dysfunction and RAAS 10
E. Aim of the thesis research 13
II. MATERIALS AND METHODS 16
1. Animals 16
2. Surgical procedures for clipping bilateral renal arteries 16
3. Blood pressure measurement 17
4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) of the rat brain 18
5. Western blot 19
6. Evaluation of tissue hypoxia using hyproxyprobe 20
7. ELISA analysis 20
8. PCR 21
9. Tissue processing and immunohistochemistry 21
10. Quantitative image analysis 23
11. Preparation of mouse brain endothelial cells 24
12. Measurement of reactive oxygen species generation 24
13. Intracerebroventricular infusion 25
14. Tissue processing and histological assessment 26
15. Behavioral assessment 27
16. Statistical analysis 28
17. Tissue dissection for single cell dissociation of the white matter 28
18. White matter dissociation for single cell sequencing (scRNA-seq) 29
19. Single cell library construction 30
20. Data processing, cell clustering and data analysis 30
III. RESULTS 32
Part A. Establishment of an animal model of white matter injury 32
1. RVH induces progressive white matter hyperintensities 32
2. Pathological alterations in the white matter of RVH rats 41
3. Changes in glial cells in RVH-induced white matter lesions 51
4. Evidence of Tau pathology in RVH-induced white matter injury 55
Part B. Ang II-mediated BBB disruption in RVH model 64
1. BBB disruption in RVH rats 64
2. Potential implication of MMP-9 immunoreactivity in RVH-induce white matter injury 71
3. Increased Ang II in RVH rats 82
4. Effect of the Ang II blocker on brain endothelial cells 85
5. Effect of the Ang II blocker in RVHT rat 88
Part C. Single cell RNA sequencing analysis of glial transcriptomics in RVH model 97
1. Clustering of different cell type in the white matter 97
2. Cell-type specific analysis of DEGs in RVH-induced white matter injury 105
3. Identifying glial subtypes with differing functions 110
V. SUMMARY AND CONCLUSION 129
REFERENCE 130
국문 요약 144
