Genomic and Transcriptomic approaches for elucidation of increased β-carotene production in Escherichia coli mutant strain
- 주제(키워드) beta-carotene , Escherichia coli , whole genome sequencing , RNA-seq
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 이평천
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032538
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
In a previous study, a mutant XL1-Blue strain (Ajou 45) with high β-carotene production was screened through random mutagenesis using gamma-ray irradiation. To understand why the Ajou 45 strain has high β-carotene production, genome resequencing was performed, and the genome sequences of the wild-type XL1-Blue and Ajou 45 strains were compared and analyzed. Mutations were observed in the open reading frames (ORF) of eleven genes, including cyaA genes encoding an adenylyl cyclase that synthesizes cAMP using ATP as a precursor. After knocking out the cyaA gene, higher amount of β-carotene was produced than that in the wild-type XL1-Blue strain. In addition, β-carotene production reduced with increasing cAMP levels. cAMP is a transcriptional regulator that binds to cAMP receptor protein (CRP). The expression levels of 532 genes regulated by the cAMP-CRP complex were compared by whole-transcriptome analysis with total RNA sequencing (RNA-seq). The aroA, fucO, and yqeF genes were overexpressed in the Ajou 45 strain compared with the wild-type XL1-Blue strain. aroA, fucO, and yqeF were overexpressed in a strain that produces β-carotene through a plasmid system and a strain (Beta1 strain) that produces β-carotene through an integration system, and then, β-carotene production levels were compared. When aroA, fucO, and yqeF were overexpressed, the production of β-carotene increased. Thus, the Ajou 45 strain, which has increased β-carotene production through random mutagenesis, harbors a mutation in the cyaA gene compared to wild-type XL1-Blue strain, resulting in reduced cAMP synthesis and increased expression of aroA, fucO, and yqeF. The process of screening strains with increased productivity of target products through random mutagenesis and securing candidate genes directly involved in the production of target products using genomics and transcriptional analysis enables high probability of securing improved strains.
more초록/요약
베타카로틴의 생산량이 높은 돌연변이 XL1-Blue인 Ajou 45는 이전 연구에서 감마선 조사를 통한 무작위 돌연변이 생성으로 선별하였다. Ajou 45 균주에서 베타카로틴 생산량이 왜 높은지 이해하기 위해 게놈 재시퀀스를 실시하여 야생형 XL1-Blue와 Ajou 45의 게놈 서열을 비교 분석하였다. 게놈상의 돌연변이는 ATP를 전구체로 사용하여 cAMP를 합성하는 아데닐 시클라아제를 암호화하는 cyaA 유전자를 포함하여 11개 유전자의 개방 판독 프레임(ORF)에서 관찰되었다. cyaA 유전자를 야생형 XL1-Blue 게놈에서 제거하였을 때 더 많은 양의 β카로틴이 생성되었다. 또한, cAMP 수준이 증가함에 따라 β-카로틴 생산이 감소하였다. cAMP는 cAMP 수용체 단백질(CRP)에 결합하는 전사 조절제이다. cAMP-CRP 복합체에 의해 조절되는 532개 유전자의 발현 수준은 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)을 통해 비교되었다. 전사체 분석을 통해 선별된 aroA, fucO 및 yqeF 유전자를 과발현 시키기 위해 각 유전자를 플라스미드에 삽입하였고 베타카로틴 생합성 유전자가 삽입되어있는 플라스미드와 함께 야생형 XL1-Blue 균주에 도입하여 베타카로틴 생산량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 베타카로틴 생합성 유전자가 게놈에 삽입되어있는 야생형 XL1-Blue인 Beta1 균주에도 aroA, fucO, yqeF 유전자가 삽입되어있는 플라스미드를 도입하였을 때 베타카로틴 생산량이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 무작위 돌연변이 생성을 통해 베타카로틴 생산을 증가시킨 Ajou 45 균주는 야생형 XL1-Blue 균주에 비해 cyaA 유전자의 결손이 있었으며 이로인한 cAMP의 합성의 감소가 베타카로틴의 생산량을 증가시킨 것으로 확인되었다. 그리고 cAMP에 의해 형성되는 cAMP-CRP 복합체가 조절하는 유전자 중 aroA, fucO 및 yqeF 유전자는 과발현됨으로써 베타카로틴 생산량을 증가시키는 것으로 확인되었다. 무작위 돌연변이 생성을 통해 목표 물질의 생산성이 증대된 균주를 선별하고 유전체학과 전사체학 분석을 활용하여 목표 물질 생산에 직접적으로 관여하는 후보 유전자를 확보함으로써 높은 확률로 개량된 균주를 제작할 수 있다.
more목차
Chapter 1. General Introduction 1
1.1 Introduction 2
1.2 Aims of This study 6
Chapter 2. Genome resequencing of the Escherichia coli wild-type and mutant XL1-Blue strain 7
2.1 Abstract 8
2.2 Introduction 9
2.3 Materials and Methods 11
2.3.1 Strains and media 11
2.3.2 Culture conditions in flask 11
2.3.3 Carotenoids extraction and quantification 12
2.3.4 Microscopic examination 12
2.3.5 Metabolite analysis 13
2.3.6 Batch fermentation 13
2.3.7 Genome resequencing and Annotation 13
2.4 Results 24
2.4.1 Production of β-carotene in XL1-Blue and Ajou 45 24
2.4.2 Whole genome analysis of wild-type XL1-Blue and Ajou 45 26
2.4.3 Phylogenetic analysis 30
2.4.4 List of resequencing mutation in Ajou 45 32
2.4.5 The knockout of cyaA gene increases β-carotene production 35
2.4.6 A decrease in cAMP increases β-carotene production 40
2.5 Discussion 42
Chapter 3. Transcriptomic analysis of Escherichia coli wild-type and mutant XL1-Blue strains 47
3.1 Abstract 48
3.2 Introduction 50
3.3 Material and Method 52
3.3.1 Strains and media 52
3.3.2 Construction of plasmid 52
3.3.3 Batch fermentation 53
3.3.4 RNA isolation, cDNA library construction, and RNA-seq data analysis 53
3.3.5 Culture conditions in flask 54
3.3.6 Quantification of mRNA by qRT-PCR 54
3.4 Results 60
3.4.1 Batch fermentation of wild type XL1-Blue and mutant XL1-Blue at minimal medium for transcriptomics analysis 60
3.4.2 Read counts of gene regulated by cAMP-CRP complex 62
3.4.3 Overexpression of aroA gene, fucO gene, yqeF gene in complex medium and semi-define medium increases β-carotene production 73
3.4.4 The overexpression of aroA gene, fucO gene and yqeF gene in Escherichia coli, which produces β-carotene with an integration system, increases β-carotene production 78
3.5 Discussion 81
4 Conclusions 83
5 References 85
