Antibacterial Activity of Synthetic Peptides and Bacterial Pigments in Planktonic and Biofilm States
부유 및 생물막 상태에서의 합성 펩타이드와 세균성 색소의 항균 활성에 대한 연구
- 주제(키워드) Biofilm , Antimicrobial peptides , Bacterial pigments , Staphylococcus aureus
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 문은표
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032504
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
미생물 성장을 제어하는 것은 건강한 인간 생활에 필수적입니다. 따라서 농업, 식품산업, 의료산업 등 많은 분야에서 미생물을 물리적, 화학적, 생물학적 과정으로 제어하는 방법이 지속적으로 연구되고 있다. 특히, 미생물에 의해 생성된 생물막은 거의 단단한 표면에서부터 살아있는 유기체의 조직까지 형성될 수 있다. 플랑크톤 박테리아가 아닌 생물막 내부에 있는 박테리아도 숙주 면역 체계를 공격하고 상당히 높은 수준의 항생제 내성을 가지고 있다. 이러한 이유로 생물막 내의 박테리아를 죽이는 것은 상당히 어려운 일입니다. 따라서 생물막을 효과적으로 제어하는 것이 매우 중요하다. 최근 항균 펩타이드(Antimicrobial Peptide, AMP)와 세균성 색소를 이용한 미생물 제어 연구가 각광을 받고 있다. 그들은 광범위한 미생물을 제어할 수 있는 능력을 가지고 있을 뿐만 아니라 기존 항생제의 문제점을 해결할 수 있는 능력도 가지고 있다. 본 연구에서는 6개의 합성 펩타이드와 2개의 박테리아 색소인 violacein과 prodigiosin이 플랑크톤 상태와 생물막 상태 모두에서 항균 활성에 대해 광범위하게 조사하였다. 6개의 합성 펩타이드와 2개의 색소 모두 동물 세포에 처리했을 때 밝혀진 바와 같이 유의미한 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 총 41종의 병원성 박테리아를 항균 활성의 표적으로 실험하였고, 또한 pH 및 온도 안정성과 같은 생화학적 특성도 연구하였다. Violacein과 prodigiosin에 의한 질병 방제 효능은 GFP-tagged 작물 병원균과 함께 생체 내 분석 시스템을 사용하여 평가되었으며 결과는 병변의 극적인 감소를 보여주었다. 추가 연구에서는 합성 펩타이드와 박테리아 색소가 플랑크톤 박테리아의 성장뿐만 아니라 자체적으로 형성된 생물막도 효과적으로 억제한다는 사실을 입증하였다. MTT 분석과 크리스탈 바이올렛 염색 분석은 KCM12, KCM21, DBHC11, violacein 및 prodigiosin이 Staphylococcus aureus biofilm에서 박테리아 세포 생존력과 biofilm biomass를 유의하게 감소시켰다. 흥미롭게도 이들은 항생제 감수성 S. aureus 균주의 생물막뿐만 아니라 항생제 내성 S. aureus 균주의 생물막에도 항균 효과가 있었다. 생물막에 대한 현저한 억제를 시각화하고 LIVE/DEAD 세균 생존능 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 광범위한 분석을 수행하였다. CLSM 데이터의 3D 이미징 분석은 KCM12, KCM21, DBHC11, violacein, prodigiosin이 생물막 안에 내재되어 있는 세포에 영향을 줄 만큼 충분히 투과성이 있음을 보여주었다. 현저한 투과성은 생물막 불활성화의 효과에 기여하는 합성 펩타이드 및 박테리아 색소의 중요한 특징일 수 있다.
more초록/요약
Controlling microbial growth is essential for healthy human life. Therefore, in many fields such as agriculture, food industry, medical industry, etc., methods of controlling microorganisms by physical, chemical, and biological processes are continuously being researched. In particular, biofilms produced by microorganisms can be formed from almost solid surfaces to tissues of living organisms. Bacteria that are internal to biofilms rather than planktonic bacteria also attack the host immune system and have significantly higher levels of antibiotic resistance. For this reason, killing the bacteria within the biofilm is quite a challenge. Therefore, it is very important to effectively control the biofilm. Recently, research on controlling microorganisms using antimicrobial peptides (AMPs) and bacterial pigments is in the spotlight. They not only have the ability to control a wide range of microorganisms, but also have the ability to solve problems with existing antibiotics. In this study, six synthetic peptides and two bacterial pigments, violacein and prodigiosin were extensively examined for the antibacterial activity both in planktonic and biofilm states. All the six synthetic peptides and the two pigments exhibited no significant cytotoxic effect as revealed when treated to animal cells. Total of 41 different pathogenic bacteria were then tested as the targets for their antimicrobial activity. Furthermore, their biochemical natures such as pH and temperature stabilities were examined as well. The efficacy of disease control by violacein and prodigiosin was evaluated using an in vivo assay system with the GFP-tagged crop pathogen, and the results showed dramatic reduction in lesions. Further studies demonstrated that the synthetic peptides and bacterial pigments effectively inhibited not only the growth of planktonic bacteria, but also the biofilms formed by themselves. MTT assay and crystal violet staining assay revealed that KCM12, KCM21, DBHC11, violacein, and prodigiosin significantly reduced bacterial cell viability and biofilm biomass in Staphylococcus aureus biofilm. Interestingly, they have antibacterial effects not only on biofilms of antibiotic-susceptible S. aureus strains but also on biofilms of antibiotic-resistant S. aureus strain. The remarkable inhibition on the biofilm was visualized and extensively analyzed using the LIVE/DEAD bacterial viability assay and confocal laser scanning microscopy (CLSM). The 3D imaging analysis of CLSM data showed that KCM12, KCM21, DBHC11, violacein, prodigiosin were sufficiently permeable to affect the cells embedded in the biofilm. Prominent permeability may be an important feature of synthetic peptides and bacterial pigments that contributes to the effectiveness of biofilm inactivation.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II. MATERIALS & METHODS 6
1. Materials 6
2. Synthetic peptides by Synthetic Combinatorial Libraries (SCLs) 7
3. Culture condition of bacterial strain 7
4. Biofilm formation 7
5. Determination of viability of the bacteria in biofilm 8
6. In vitro cytotoxicity test 8
7. Top agar assay 9
8. Synthetic peptides and bacterial pigments biochemical stability 9
9. Crystal violet staining 10
10. LIVE/DEAD bacterial viability assay 10
11. Competent cell and electroporation 11
12. Extracted plasmid DNA restriction enzyme digestion & gel electrophoresis 11
13. In vivo assay 12
14. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) 12
15. Statistical analysis 12
III. RESULTS 14
1. Inhibitory activity of six synthetic peptides and two bacterial pigments against various pathogens 14
2. Biochemical stability of synthetic peptides and bacterial pigments 15
3. Cytotoxicity analysis of synthetic peptides and bacterial pigments 16
4. Verification of transformation 16
5. In vivo assay of inhibitory activity using GFP-tagged Pectobacterium carotovorum 17
6. Inhibitory activity of synthetic peptides and bacterial pigments against Staphylococcus aureus biofilm 18
6.1 Determination of bacterial viability of the bacteria in biofilms 18
6.2 Biofilm biomass assessment 19
6.3 2D analysis of biofilm treated with synthetic peptides and bacterial pigments using LIVE/DEAD assay 20
6.4 3D analysis of inhibitory activity of synthetic peptides and bacterial pigments using CLSM 20
IV. DISCUSSION 23
V. LIST OF FIGURES 27
VI. LIST OF TABLES 49
VII. REFERENCES 56
국문요약 61
