Development of anti-integrin cyclic peptides and anti-EGFR monobody for specific delivery of payloads into targeted tumors
- 주제(키워드) Cyclic peptide , monobody , integrin , EGFR , immunotoxin
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032476
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Anti-cancer therapy is the use of various methods to treat cancer, such as surgery, chemotherapy, radiation, immunotherapy, and targeted therapy. The aim of this treatment is to kill cancer cells and prevent them from growing and spreading. This can help prevent the cancer from spreading to other parts of the body and can also alleviate symptoms and improve the patient's quality of life. Targeted therapy is a way to treat cancer that uses drugs or other substances to attack specific molecules or proteins involved in the growth and spread of cancer cells. These molecules or proteins can be found on the surface of cancer cells or be part of the signaling pathways that allow cancer cells to grow and multiply. Targeted therapy can kill cancer cells without harming healthy cells, which can help reduce side effects and improve treatment effectiveness. Antibodies are proteins produced by the body's immune system that can be used in targeted therapy. Antibody drugs are designed to target specific molecules or proteins and are used to treat various conditions such as cancer, autoimmune diseases, and infectious diseases. Antibody drugs that target molecules such as epidermal growth factor receptor (EGFR) and integrin are commonly used to treat cancer, but these drugs have limitations. For example, some cancer cells may be resistant to the effects of these drugs, and the drugs may also have side effects. As a result, researchers are continuing to study these drugs and develop new and improved versions to overcome these limitations. In this study, I used a class of molecules known as antibody mimetics as delivery agents to transport payloads, such as antibodies or toxins, to specific target cells. I focused on tumor-associated integrins and the EGFR as targets for the treatment of solid tumors, as they are frequently overexpressed in these types of tumors. I developed cyclic peptides that have a strong and specific binding affinity for the integrin αvβ5 and αvβ6. The ability of these peptides to bind effectively to the cell surface is largely dependent on their high binding affinity, but their biological function is also influenced by their pH-dependence. To optimize the function of these peptides, I engineered them to have a high pH-dependence, which allows them to function effectively in different pH environments. As a result, I developed a cyclic peptide with a high affinity, high specificity, and high pH-dependence for the integrin αvβ6, but unfortunately was not able to achieve the same success with the integrin αvβ5. In the second part of this study, I turned my attention to the EGFR as a target for cancer treatment. To identify potential binding agents for EGFR, I screened cyclic peptides, affibodies, and monobodies for their ability to bind to this receptor. Of these, I found that monobodies were the best candidates for further engineering. To optimize the function of these monobodies, I performed histidine scanning on the paratope (the part of the monobody that interacts with the target) to generate a pH-dependent binder. In this study, I generated a mutant version of a protein called ERv3-Ras03 by combining single mutations. This mutant protein showed a significantly faster dissociation rate compared to the wild type protein at pH 6.0, with a 10-fold increase in the rate constant. Additionally, ERv3-Ras03 showed improved cytosolic access for the cytosolic-penetrating antibody, Ras03 compared to a control, in4-Ras03. In the final part of this study, I developed an immunotoxin that targets the EGFR and has an enlarged therapeutic window. To achieve this, I fine-tuned the affinity of the immunotoxin for EGFR so that it could selectively bind to normal tissues and tumor cells with varying levels of EGFR expression. This allowed me to optimize the immunotoxin's affinity for EGFR in order to improve its specificity and minimize off-target effects. As a result, the affinity-optimized immunotoxin showed a 4-fold increase in the therapeutic window compared to a high-affinity immunotoxin, indicating that it may have a better safety profile and be more effective at treating cancer.
more초록/요약
항체모방체 (Antibody mimetics)는 항체만큼 높은 결합 특이성, 높은 친화도를 가지는 항체 유사 스캐폴드이다. 고리형 펩타이드 (Cyclic peptide), 어피바디 (Affibody), 모노바디 (Monobody) 등 다양한 종류의 항체 모방체가 개발되었다. 항체모방체는 항체와 비슷한 특징을 가지지만 작은 크기를 가진다는 특징을 가지고 있으며, 현재 전임상 및 임상 연구에서 암 진단 및 치료제 개발을 위한 광범위한 연구가 진행중이다. 항체모방체의 이런 작은 크기는 항체 모방체들을 IgG 에 융합하여 다중 특이성 항체를 제작하는 데에 사용된다. 나는 이 연구에서 항체모방체를 전달제로 사용하여 표적 세포에 항체 또는 독소와 같은 단백질들을 효과적으로 전달할 수 있는 항체모방체를 개발하는 연구를 진행하였다. 종양 관련 인테그린 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 고형암에 과발현 된다는 특징이 있으며, 고형암 치료제 개발에 있어 상당히 매력적인 표적이다. 나는 첫번째로, 우리 연구실에서 개발한 세포질 침투항체를 종양 관련 인테그린을 발현하는 세포에 전달할 수 있는 효율을 증가시키기 위해 인테그린 αvβ5 와 인테그린 αvβ6 을 특이적으로, 높은 결합친화도로 표적할 수 있는 고리형 펩타이드를 개발하였다. 그렇지만 세포질침투항체가 세포질로 전달되는 양을 증가시키기 위해서는 높은 결합친화도 뿐만 아니라, 엔도솜 환경에서 표적과 해리될 수 있도록 pH 의존적 결합능이 중요한 요소로 작용한다는 사실을 실험을 통해 확인하였다. 후속 연구로 저는 원형펩타이드가 더 높은 pH-의존성을 가지며 표적 인테그린에 결합할 수 있도록 이스트디스플레이를 이용하여 엔지니어링 하여 인테그린 αvβ6 에 대해서는 높은 pH-의존적 결합을 가지는 클론을 선별하였지만 인테그린 αvβ5 에 대한 클론은 선별할 수 없었다. 두번째 연구는, 첫 번째와 유사한 접근 방식으로 EGFR 을 표적으로 하여 세포질 침투항체를 전달하는 연구를 진행하였다. EGFR 을 표적으로 하는 고리형 펩티드, 어피바디 및 모노바디를 스크리닝하여 최적의 항체모조물을 검증과정을 통해 선별하였다. 고리형 펩타이드는 EGFR 에 특이적으로 결합하였으며 EGFR 에 결합하여 세포 내재화까지 유도하였으나, EGFR 에 대한 너무 낮은 친화도를 가지고 있어서 적합하지 않다고 판단하였다. 또한, 어피바디의 경우, 높은 친화도를 가졌으나, 세포질 침투항체가 세포질로 이동하는 효율이 매우 낮았으며, 앞서 연구했던 결과와 일치하게 pH-의존적 결합이 보이지 않아서 그런 것이라 판단하였다. 모노바디는 높은 친화도와 어느 정도의 pH-의존적 결합을 보여 in4-Ras03 와 유사한 정도의 세포질 이동 효율을 가지는 것을 확인하였다. 앞선 결과들을 토대로 추후 연구의 탬플릿으로 모노바디를 선정하였다. 모노바디의 파라토프에 각각 히스티딘 스캐닝을 수행하여 얻어진 결과를 토대로 단일 돌연변이들의 조합을 이용하여 pH 의존성을 극대화시킨 ERv3 클론을 제작하였다. ERv3-Ras03 은 야생형 모노바디를 융합한 ER-Ras03 에 비해 pH 6.0 에서 10 배 더 빠르게 해리되는 결과를 보여줬다. 또한, ERv3-Ras03 은 in4-Ras03 에 비해 세포질로 이동하는 항체의 양이 증가된 것으로 확인되었다. 마지막으로, 다양한 EGFR 발현 수준에서 정상 조직 및 종양 세포에 대해 선택적으로 결합할 수 있도록, EGFR 친화도를 미세 조정하여 확대된 치료 범위를 갖는 EGFR 를 표적하는 면역독소를 개발하였다. EGFR 은 종양세포에 과발현 되지만 일반 세포에도 어느정도 발현된다는 문제점을 가지고 있어 세포독성 효과가 높은 약을 사용할 경우 매우 좁은 치료범위를 가진다는 한계점을 가지고 있다. 나는 이러한 한계점을 극복하기 위해, EGF 에 대해 다양한 친화도를 가지는 면역독소를 개발하였고, 이를 EGFR 을 과발현하는 종양조직과 일반세포 수준으로 발현하는 세포를 이용하여 실험하여 약 20 nM 정도의 EGFR 친화도를 가지는 면역독소가 in vitro 실험에서 가장 넓은 치료범위를 보이는 것을 확인하였으며, 본 클론을 이용하여 동물실험에서의 독소와 치료효과를 확인한 결과, 높은 친화도를 가지는 면역독소보다 친화도를 조절한 면역독소가 약 4 배 더 넓은 치료범위를 가지는 것을 확인하였다. 상기 학위 과정 동안 나는 종양 관련 인테그린을 표적하는 원형 펩타이드 및 EGFR 을 표적하는 모노바디를 엔지니어링 함으로써 세포질 침투항체를 인테그린과 EGFR 이 과발현된 세포에 더 많이 전달될 수 있도록 개량하였으며, 슈도모나스 유래 독소를 EGFR 발현 종양세포에 조금 더 특이적으로 전달할 수 있도록 개량하여, 궁극적으로 여러 단백질 페이로드들을 종양세포로 잘 전달될 수 있도록 개량하는 연구를 진행하였으며, 이를 통해 종양에 여러 페이로드 단백질들을 전달하도록 표적 도메인을 개량할 때 엔지니어링의 방향성을 제시하였다.
more목차
CHAPTER 1. General introduction 1
1.1 Antibody mimetics 1
1.2 Integrin and EGFR targeting strategies in anti-cancer drug development 5
1.3 Immunotoxins 9
CHAPTER 2. Affinity maturation of cyclic peptides targeting integrins αvβ5 and αvβ 6 11
2.1 Abstract 11
2.2 Introductions 12
2.3 Materials and Methods 15
2.3.1 Plasmid construction 15
2.3.2 Cell culture 15
2.3.3 Expression and purification of antigens and cyclic peptide-fused antibodies 15
2.3.4 High-performance liquid chromatography 16
2.3.5 Cyclic peptide phagemid library construction and screening 16
2.3.6 ELISA 17
2.3.7 Flow cytometry 18
2.3.8 Bio-layer Interferometry 18
2.3.9 Cell viability assay 19
2.3.10 Split-GFP complementation assay 19
2.3.11 Cyclic peptide stability in mouse serum 19
2.3.12 In vivo Biodistribution 20
2.3.13 Yeast surface display library construction and screening 20
2.3.14 Statistical analysis 21
2.4 Results 23
2.4.1 Construction and validation of integrin αvβ5 and integrin αvβ6 extracellular domain 23
2.4.2 RGD10-based integrin αvβ5-target affinity mature cyclic peptide screening using phage display 25
2.4.3 Validation of affinity maturated anti-integrin αvβ5 cyclic peptide variants in antibody-fused format 28
2.4.4 in4-Ras03 increased integrin αvβ5-mediated cell surface binding and antiproliferation activity toward oncogenic RASMUT cell lines compared with inRas 03 28
2.4.5 in4-Ras03 increased tumor homing in in vivo integrin αvβ5-expressing CDX model in mouse with increased serum stability 33
2.4.6 Generation of integrin αvβ6-targeting cyclic peptide and affinity maturation of in4 cyclic peptide for integrin αvβ5 using phage display 35
2.4.7 Verification of binding specificities and biological activities of cyclic peptides targeting integrin αvβ5 (5P variants) and integrin αvβ6 (6P variants) in Ras03 fusion format 38
2.4.8 Screening and validation of pH-sensitive cyclic peptides using yeast surface display 47
2.5 Discussion 53
CHAPTER 3. Development of antibody mimetics with pH-sensitive binding to Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) 55
3.1 Abstract 55
3.2 Introductions 56
3.3 Materials and Methods 59
3.3.1 Plasmid construction 59
3.3.2 Cell culture 59
3.3.3 Protein expression and purification 59
3.3.4 High-performance liquid chromatography 60
3.3.5 ELISA 60
3.3.6 Flow cytometry 60
3.3.7 Bio-layer interferometry 61
3.3.8 Internalization assay 61
3.3.9 Confocal microscopy 62
3.3.10 Split-NanoLuc complementation assay 62
3.3.11 Statistical analysis 63
3.4 Results 64
3.4.1 Construction and validation of EGFR ECD, EGFR Domain III-IV fragment, EGFR dimer 64
3.4.2 Validating the biophysical properties and EGFR-binding specificities of EGFR-targeting cyclic peptides in IgG-fused format 64
3.4.3 Validating the EGFR-binding specificities and biological activities of EGFR-targeting affibody (Z1908) and 2-helix affibody format (Z1908-2H) in IgG fusion format 70
3.4.4 Generation of EGFR-targeting monobody fused Ras03 (ER-Ras03) 74
3.4.5 Directed evolution for generating pH-sensitive EGFR-targeting monobody 77
3.4.6 ERv3-Ras03 exhibits increased cytosolic accumulation compared to ER-Ras 03 80
3.5 Discussion 85
CHAPTER 4. Development of an immunotoxin that expands the therapeutic window by reducing toxicity utilizing a monobody optimized for EGFR affinity 87
4.1 Abstract 87
4.2 Introductions 88
4.3 Materials and Methods 91
4.3.1 Plasmid construction 91
4.3.2 Cell culture 91
4.3.3 Protein expression and purification 91
4.3.4 ELISA 92
4.3.5 Flow cytometry 92
4.3.6 Bio-layer interferometry 93
4.3.7 Cell viability assay 93
4.3.8 Animal study 94
4.3.9 Statistical analysis 95
4.4 Results 96
4.4.1 Construction and generation of EGFR-targeting immunotoxin variants (ER-PE24) with different EGFR binding affinity 96
4.4.2 ER-PE24 binds cell surface EGFR in proportion to cellular EGFR expression levels and EGFR affinity 100
4.4.3 ER-PE24 with intermediate EGFR affinity (ER/21-PE24) potently kills EGFR overexpression cell line (A431) while decreased cytotoxicity to normal level EGFR expression cell line (HT29) which exhibits expanded therapeutic index in vitro 102
4.4.4 ER/21-PE24 shows increased therapeutic index while remaining the antitumor potency but reducing acute toxicity in mouse CDX model 106
4.5 Discussion 111
REFERENCE 113
ABSTRACT IN KOREAN 121
PUBLICATIONS AND PATENTS 123
