Eosinophil Activation in Severe Asthma
- 주제(키워드) Eosinophil
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박해심
- 발행년도 2023
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032467
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Eosinophil Activation in Severe Asthma Background: Asthma is a chronic inflammatory disease characterized by eosinophilic infiltration in the airway mucosa. Patients with mild-to-moderate asthma are treated with regular anti-inflammatory medications; however, patients with severe asthma (SA) have persistent eosinophilia, which requires the use of additional controllers such as systemic steroids or biologics. Thus, eosinophils are the major effector cells in asthmatic airways, and persistent eosinophilia with increased levels of eosinophil granular products, such as eosinophil cationic protein (ECP) and eosinophil-derived neurotoxin (EDN), is observed in the serum/airway secretions of patients with SA. Interleukin-5 (IL-5) and IL-5 receptor alpha subunit (IL-5Rα) are key mediators of eosinophil activation; IL-5/IL-5Rα antibodies can reduce asthma exacerbation (AE) and improve control status in patients with SA. Recent studies have demonstrated that patients with SA had higher levels of eosinophil extracellular traps (EETs)-forming eosinophils. EETs can activate airway epithelial cells (AECs), thereby enhancing type 2 inflammation. Therefore, we hypothesized that EETs induce autoimmune responses to epithelial autoantigens, contributing to the severity of asthma, and evaluated the efficacy of anti-IL-5Rα antibody candidates in eosinophilic inflammation. Objectives: This thesis has investigated: 1) the levels of circulating epithelial autoantigens and epithelial autoantigen–specific antibodies (Abs) in patients with SA compared to those with nonsevere asthma (NSA); 2) the association of epithelial autoantigen–specific immunoglobulin G (IgG) with clinical parameters in asthmatics; 3) in vitro/in vivo effects of EETs on epithelial autoantigen–specific IgG production and their biological effects on airway inflammation; 4) the efficacy of anti-IL-5Rα antibody candidates using peripheral blood eosinophils (PBEs) of severe asthmatics. Methods: In the first study, 41 NSA patients, 11 SA patients, and 26 healthy controls (HCs) were enrolled to evaluate the clinical significance of epithelial autoantigens and epithelial autoantigen–specific IgG in the pathogenesis of asthma. The expression levels of cytokeratin (CK) 18, CK19, CK18-specific IgG, and CK19-specific IgG were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). PBEs from patients with SA were stimulated with epithelial antigen–specific Abs to investigate the induction of EETs. EDN level was also measured using ELISA, and the levels of eosinophil-derived DNA were determined using the Quant-iT™ PicoGreen dsDNA kit. To assess the effects of dexamethasone, severe eosinophilic asthma (SEA) and EET-mediated mouse models were established. The levels of CK18/ CK19 in lung tissues were measured using western blotting. The serum levels of CK18- and CK19-specific Abs in the mouse models were evaluated using ELISA. In the second study, PBEs were collected from patients with SA and HCs. Anti-IL-5Rα Abs were obtained from Prof. Yong-Sung Kim, University of Ajou, Suwon. The efficacy of anti-IL-5Rα Abs was evaluated using eosinophil proliferation (measured by CTG assays) and eosinophil apoptosis through antibody-dependent cell–mediated cytotoxicity (ADCC) assays. Results: In the first study, significantly higher levels of serum CK18 and CK19 were noted in asthmatics than in HCs. Among asthmatics, notably higher levels of serum CK18 and CK18-specific IgG were found in the SA group than in the NSA group, while no differences were noted in CK19 or CK19-specific IgG levels between the two groups. When PBEs from patients with SA were treated with Abs, both CK18- and CK19-specific Abs enhanced the phosphorylation of p38, and increased the release of dsDNA, EDN, and EETs from the PBEs. In the second study, anti-IL-5Rα Ab (5R65.7) significantly reduced the IL-5-dependent eosinophil proliferation and increased eosinophil depletion through natural killer (NK) cell–mediated Ab-dependent cell cytotoxicity (ADCC) compared to the benralizumab analogue. Conclusion: EETs could enhance CK18-induced autoimmune responses, further stimulating EET production and type 2 responses in SA, which is a new therapeutic target. In addition, the novel humanized anti-IL-5Rα Ab (5R65.7) was suggested as a potent biologic targeting SEA.
more초록/요약
연구배경: 천식은 다양한 표현형을 나타내는 만성 염증성 기도 질환이다. 천식을 앓는 대부분의 환자들은 항 염증 치료만으로도 증상이 완화되지만, 중증 천식 환자들은 추가적인 약물 치료가 필요하다. 또한 중증 천식 환자의 경우, 적절히 치료하지 않으면 지속적인 기도 염증과 폐기능 저하로 이어져, 이들의 기도 염증 기전에는 다른 기전이 존재함을 시사한다. 최근 중증 천식의 병인 기전 연구에서 자가면역 기전에 대한 연구로 상피세포 유래 자가항원에 대한 항체 수치 증가가 보고되었으나, 중증 천식에서 상피 자가항원 특이 면역글로불린 G (IgG)의 역할은 아직 정확히 규명되어 있지 않다. 제2형 면역 반응의 활성화 경로는 매우 다양하며, Th2 세포 및 ILC2 세포에서 유래된 제2형 사이토카인 (특히 IL-5)은 호산구 활성화의 주된 매체이다. 또한 중증 천식 환자에서는 호산구 수뿐만 아니라 호산구 유래 과립 단백질 및 호산구 세포 트랩 (EET) 수치가 증가해 있고, 이는 기도 상피세포의 활성화를 통하여 제2형 기도 염증 반응을 증폭시킨다. 따라서 호산구는 천식의 병인과 관련된 주요 과립구로, 제2형 기도 염증을 주도하는 주 작동세포로, 핵심 매개체인 IL-5/IL-5Rα를 차단하여, 호산구 활성화 및 제2형 기도 염증의 효과적인 제어가 가능하다. 목적: 본 연구는 1) 중증 천식과 비중증 천식 환자에서 상피 자가항원 및 상피 자가항원 특이 항체의 발현 수준을 비교하고, 2) 중증 천식에서 상피세포 유래 자가항원에 대한 특이 항체 IgG와 천식 환자의 임상 지표의 관계를 규명하고, 3) EET가 상피세포 자가항원 및 이에 대한 IgG 생성에 미치는 영향을 관찰하여 자가 면역 기전을 규명하고자 하였으며, 4) 또한 중증 천식의 항체 치료제인 항 IL-5Rα 항체 후보제들의 효능을 평가하였다. 방법: 첫 번째 연구를 위하여, 41명의 비중증 천식환자, 11명의 중증 천식 환자 및 26명의 건강 대조군을 등록하였다. 혈중 사이토케라틴 (CK)18, CK19, CK18-IgG 및 CK19-IgG의 발현 수준은 효소면역측정법 (ELISA)을 통해 평가하였다. EET의 유도를 조사하기 위해, 중증 천식 환자의 호산구를 CK18-IgG로 자극하였다. 또한 호산구 유래 신경독소 (EDN)를 ELISA로 측정하였고, 호산구 유래 DNA는 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA kit로 평가하였다. 스테로이드의 효과를 평가하기 위해, 중증 호산구성 천식(SEA)과 EET 매개 마우스 모델을 확립하였다. 폐 조직내 CK18/CK19 단백질 발현량은 western blot으로 측정하였으며, 혈중 CK18-IgG/CK19-IgG 농도는 ELISA로 측정하였다. 두 번째 연구인 항 IL-5Rα 항체의 효능을 평가하기 위해, 건강 대조군과 SEA 환자들로부터 호산구를 분리하였고, CTG assays로 호산구 증식능을 측정하였으며, 항체 의존적 세포매개 세포 독성 (ADCC)을 이용하여 호산구 세포사멸능을 평가하였다. 결과: 첫 번째 연구에서, 천식 환자의 혈청 내 CK18/CK19 농도는 건강대조군에 비해 유의하게 높았고, CK18 농도는 중증 천식 환자에서 비중증 천식 환자에 비해 유의미하게 높았다 (CK19 농도는 유의한 차이가 없었다). 또한 CK18-IgG 농도도 중증 천식 환자에서 비중증 천식 환자보다 유의하게 높았다 (CK19-IgG 양은 유의미한 차이가 없었다). 천식의 중증도 관련 변수와 CK18과의 연관성을 평가했을 때 Total eosinophil count와 CK18-IgG는 CK18과 양의 상관관계를 보였고, FEV1(%)값과는 음의 상관관계를 보였다. 추가로 FEV1(%)값과 Total IgG, CK18-IgG, CK19-IgG의 연관성을 평가했을 때 CK18-IgG만 유의미한 음의 상관관계를 보였다. 중증 천식 환자 유래 호산구에 CK18-IgG 항체를 처리했을 때, p38의 인산화와 호산구 유래 dsDNA, EET, EDN의 농도가 유의하게 증가하였다. 두 번째 연구에서, 항 IL-5Rα 항체 후보 물질 중, 5R65.7 형은(benralizumab 유사체에 비해) 자연살해 (NK) 세포 매개 ADCC를 통한 호산구 세포사멸을 유의하게 증가시키고, IL-5-의존성 호산구 증식은 유의하게 감소시켰다. 결론: EET는 기도 상피세포 유래 자가항원인 CK18 항원에 대한 항체 생성과 자가면역 반응을 강화하여, EET 생성과 제2형 면역반응을 증폭한다. 새로운 인간화 항 IL-5Rα 항체 (5R65.7)는 강력한 ADCC 기능을 통해 SEA를 위한 우수한 항체 치료제 후보물질로 사용될 수 있다.
more목차
CHAPTERⅠ 1
Ⅰ. INTRODUCTION 2
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 4
A. Study subjects and clinical parameters 4
B. Measurement of total IgG, CK18/CK19, and CK18/CK19-IgG Ab 4
C. Isolation of PBEs and EETs 5
D. Measurement of dsDNA and eosinophil granule protein 6
E. AEC culture and stimulation 6
F. In vivo experiments 6
G. Measurement of total IgG and CK18-IgG in mice 7
H. Western blotting analysis 8
I. Immunofluorescence analysis 8
J. Statistical analysis 9
Ⅲ. RESULTS 10
A. Clinical characteristics of the study subject 10
B. Levels of serum CK18 (but not CK19) were increased in patients with SA compared to those with NSA 12
C. Increased levels of serum CK18-specific IgG in patients with SA compared to those with NSA 13
D. Comparison of circulating CK18 levels according to asthma severity 14
E. Correlation between serum CK18- and CK19-specific IgG levels and lung function parameters 15
F. Degranulation of eosinophils and EETs increased the expression of epithelial autoantigen in AECs 16
G. CK18-specific IgG antibody induced eosinophil degranulation and EET formation 20
H. CK18/CK18-IgG production in the mouse model of SEA 22
I. Effect of EETs on CK18/CK18-IgG production in mice 25
Ⅳ. DISCUSSION 28
CHAPTER Ⅱ 32
Ⅰ. INTRODUCTION 33
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 35
A. Isolation of peripheral blood eosinophils (PBEs) and NK cells 35
B. Cell proliferation assays (CTG assays) 36
C. Ab-dependent cell–mediated cytotoxicity (ADCC) assays 36
D. Statistical analysis 37
Ⅲ. RESULTS 38
A. 5R65.7 significantly reduced eosinophil proliferation 38
B. 5R65.7 potently induced NK cell–mediated ADCC against eosinophils 40
Ⅳ. DISCUSSION 41
Ⅴ. CONCLUSIONS 43
REFERENCES 44
