난황 알부민 알레르기 마우스 모델에서 다가형 사람 IgG 의 항알레르기 효과 검증과 기전 규명
- 주제(키워드) 알레르기 , 마우스 모델 , 면역글로불린 G , OVA-특이 IgE , OVA-특이 IgG , 사이토카인
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 남동호
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032186
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
배경: 알레르기질환은 환경 내에 존재하는 물질들에 대한 과민한 면역반응(알레르기 반응)으로 인하여 발생한다고 알려져 있다. 과거 연구들에서 건강헌혈자들의 모듬혈장으로부터 분리된 다가형 면역글로불린 G (사람 IgG)를 알레르기질환 환자들에게 정맥 혹은 피하주사로 투여 시, 알레르기질환을 호전시키는 치료효과(항알레르기 효과)가 있다고 보고된 바 있으나, 아직까지 다가형 사람 IgG 의 항알레르기 효과와 그 작용 기전은 명확하게 규명되지 않은 상태이다. 이에 연구자는 본 연구에서 난황 알부민(ovalbumin, OVA)알레르기 마우스 모델에 시판중인 주사용 다가형 사람 IgG 제제를 투여하여 항알레르기 효과를 나타내는지를 검증하고, 항알레르기 효과를 나타내는 면역학적인 기전을 규명하고자 하였다. 연구방법: OVA 알레르기 마우스 모델을 만들기 위하여 BALB/c 마우스에 OVA과 alum 을 혼합하여 복강 내로 0주, 1주, 2주에 총 3회 주사하여 감작시킨 후, 알레르기 반응을 억제하기 위한 치료제로서 사람 IgG 또는 음성 대조로 saline 혹은 사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 각 군의 처치 방식에 따라 0주, 1주, 2주에 총 3 회 피하주사로 투여하였다. 사람 IgG 와 면역증강제인 complete Freund's adjuvant (CFA)를 함께 투여한 경우 또는 아닌 경우로 서로 다른 2개의 실험조건으로 진행하였다. <사람 IgG와CFA를 혼합하여 피하주사 처치한1차 실험조건>에서는 마우스 각 군당 6마리씩 다음과 같이 총 8군으로 무작위 배정하였다. OVA로 감작시키지 않고 saline 을 처치한 군, 음성 대조군으로서 OVA 감작시킨 후 saline 만을 처치한 군, HSA 20mg 과 CFA를 혼합하여 처치한 군, OVA 감작 후CFA를 혼합한 사람 IgG를 각각 1mg, 10mg, 20mg, 50mg 처치한 군, 그리고 CFA 없이 사람 IgG 20mg 만을 3 회 처치한 군으로 분류하였다. <CFA를 처치하지 않은 2차 실험조건>에서는 BALB/c 마우스에 OVA 감작한 후 saline 또는 사람 IgG 50mg 만을 피하주사 처치한 군으로 각 군당 6마리씩 총 12마리로 실험을 실시하였다. 모든 마우스는 21일차에 희생한 후 혈액과 비장 샘플을 채취하여 분석에 사용하였다. 연구결과: 음성 대조군인 OVA 감작 후 saline 만을 처치한 군과 비교한 결과는 다음과 같다. (1) 사람 IgG 50mg을 피하주사 시 CFA 혼합 여부와 상관없이 <실험조건 1 과 2>에서OVA-특이 IgE항체 역가의 평균치가 유의하게 감소되었다(p=0.038, p=0.028, respectively). (2) <실험조건 1>에서 OVA-특이 IgG 항체 역가의 평균치가 사람 IgG 50mg 과 CFA를 함께 피하주사 하였을 때 유의하게 감소되었다(p<0.001). (3) 혈청 내 total IgE 는 <실험조건 1>의 사람 IgG 10mg을 CFA 와 함께 처치한 군과 <실험조건 2>의 사람 IgG 50mg 을 피하주사 처치한 군에서 통계적으로 유의하게 증가되었다(p=0.005, p=0.001, respectively). (4) <실험조건 1>에서 CFA 와 사람 IgG 를 20mg 처치시 또는 <실험조건 2>에서 사람 IgG 50mg 피하주사 시, 비장의 무게가 유의하게 증가되었다(p=0.024, p=0.004, respectively). (5) <실험조건 1>에서 비장세포를 OVA 와 함께 배양한 배양액의 상층액에서 사이토카인 농도를 측정한 결과, 사람 IgG 50mg 을 처치한 군에서 IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-4 의 농도가 유의하게 증가되었다(p<0.05). (6) <실험조건 1 과 2>에서 사람 IgG 전체와 사람 IgG F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체의 역가가 사람 IgG 50mg 을 피하주사 하였을 때 유의하게 증가되었다(p<0.05). 결론: OVA 알레르기 마우스 모델에서 고용량의 사람 IgG 를 피하주사 시, OVA-특이 IgE 항체의 생성을 억제하는 항알레르기 효과와 비장세포에서 여러 종류의 사이토카인 생성을 증가시키는 면역조절 효과 그리고 사람 IgG의 F(ab')2 분절에 대한 IgG 항체 반응이 유도됨을 확인할 수 있었다. 향후 다가형 사람 IgG가 항알레르기 효과를 나타내는 상세한 작용 기전을 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
more초록/요약
Background: Allergic diseases are known to be caused by an hypersensitive immune response to common environmental agents. Previous studies have reported that polyvalent immunoglobulin G (human IgG) purified from plasma pool of health blood donors has an anti-allergic effect and improves allergic diseases when administered by intravenously or subcutaneous injection. However, there are few studies that demonstrated its anti-allergic effect and mechanism of action. In this study, we tried to evaluate an anti-allergic effect of polyvalent human IgG in the ovalbumin (OVA) allergy mouse model, and to classify its therapeutic mechanism. Method: To establish an OVA allergy mouse model, 0.4mg/ml OVA and 20mg/ml aluminum hydroxide were mixed and injected into the abdominal cavity of 3 times for 2 weeks and then human IgG was administered by subcutaneous injections as a treatment to 6 weeks old female BALB/c mice. When administering human IgG by subcutaneous injection to mice, two different experimental conditions were sequentially performed depending on whether complete Freund's adjuvant (CFA)(as an adjuvant) was mixed or not. In <First experimental conditions treated by mix human IgG and CFA>, 6 animals per group were randomly assigned to a total of 8 groups as follows. A mouse group that was not sensitized with OVA, a group that was sensitized with OVA and then treated with saline, or a group that was treated by the mixture of human serum albumin (HSA) and CFA, and other mouse groups administrating by mixture of human IgG and CFA was classified with 1mg hIgG, 10mg hIgG, and 20mg hIgG and 50mg hIgG groups. In <Second experimental conditions without CFA>, after OVA sensitization, 6 mice were treated by saline or 6 mice were treated by 50mg hIgG. Blood and spleen samples were taken on the 21st day and used for analysis. Result: The negative control mouse group treated with saline and the high-dose hIgG (50mg) treated group were compared after OVA sensitization. Result, (1) high-dose human IgG significantly decreased the titer of OVA-specific IgE antibodies in both experimental conditions 1 and 2 (p=0.038, p=0.028, respectively). (2) The titer of OVA-specific IgG antibody was significantly decreased when treated by a mixture of 50mg of human IgG and CFA (p=0.028). (3) Total IgE in serum was significantly increased in mouse group, treated with a mixture 20mg of hIgG and CFA or 50mg of hIgG only, experimental conditions 1 and 2 (p=0.005, p=0.001, respectively). (4) High-dose human IgG increased, the weight of the mouse spleen (p=0.024, p=0.004, respectively). (5) High-dose hIgG (50mg) treatment significantly increased the concentrations of IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-4 cytokines in the culture supernatant of the spleen cells stimulated OVA were significantly increased in the group treated with high dose of human IgG (50mg) in experimental condition 1 (p<0.05). (6) Mouse IgG antibodies to whole molecule of human IgG and F(ab')2 fragment of human IgG were significantly increased in mouse groups treated with high doses of human IgG (50mg). Conclusion: This study showed in OVA allergy mouse model (1) high-dose human IgG treatment group significant anti-allergic effect decreasing serum levels of allergen-specific IgE. (2) Immunomodulatory effect increasing producing various cytokines from spleen cells allergen stimulation. (3) Significantly Induced mouse IgG antibodies response to both human IgG and F(ab')2 fragment of human IgG. Further research is necessary to evaluate the mechanism of exhibiting an anti-allergic effect by polyclonal human IgG.
more목차
Ⅰ. 서론 ································· 1
Ⅱ. 재료 및 방법 ····························· 3
A. 실험동물 및 실험재료 ······················· 3
1. 실험동물 ····························· 3
2. 주사제 ······························ 3
3. 실험시약 ····························· 3
B. 알레르기 마우스 모델 제작 및 실험 조건 ·············· 4
1. Ovalbumin 알레르기 모델 형성 ·················· 4
2. 사람 IgG 주사 처치 방식에 따른 실험 조건 ··········· 6
3. 처치군에 따른 주사제 피하주사 투여 방법 ············ 9
4. 혈액과 비장 샘플 수집 ······················ 9
C. 혈청 분리 및 비장 세포 배양 ···················· 9
1. 혈청 분리 및 보관 ························ 9
2. 비장 세포 분리 및 배양 후 상층액 보관 ············· 9
D. Enzyme-linked immunosorbent assay ············· 10
1. 혈청 내 ovalbumin-특이 IgE 항체 역가 측정 ········· 10
2. 혈청 내 ovalbumin-특이 IgG 항체 역가 측정 ········· 11
3. 혈청 내 total IgE 농도 측정 ·················· 11
E. Splenocyte (Cytometric Bead Array) ·············· 12
1. 난황 알부민으로 자극한 마우스 비장세포 배양액의 상층액에서 사이토카인 농도 측정 ····················· 12
F. 사람 IgG 에 대한 마우스 IgG 항체 측정 ············· 13
1. 마우스 혈청 내 사람 IgG 에 대한 마우스 IgG 항체 역가 측정································· 13
2. 사람 IgG 의 F(ab')2 분절 분리 ················· 14
3. 사람 IgG 의 F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체 역가 측정 ·································· 15
4. 사람 IgG 로부터 ovalbumin-특이 IgG 항체 분리 정제 ···· 15
5. 사람 ovalbumin-특이 IgG 의 F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체 역가 측정 ··························· 16
G. 통계분석 ····························· 17
Ⅲ. 결과 ································ 18
A. 마우스 비장의 무게 비교 ····················· 18
B. 난황 알부민으로 감작시킨 마우스에 사람 IgG 주사 후 마우스 혈청 내 ovalbumin-특이 IgE 와 ovalbumin-특이 IgG 역가 비교 ··· 20
1. 마우스 혈청 내 ovalbumin-특이 IgE 항체 역가 비교 ····· 20
2. 마우스 혈청 내 ovalbumin-특이 IgG 항체 역가 비교 ····· 22
C. 난황 알부민으로 감작시킨 마우스에 사람 IgG 주사시에 마우스 혈청 내 total IgE 농도 비교 ····················· 24
D. 마우스 비장 세포 배양 후 상층액에서 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17)농도 비교 ·········· 26
E. 사람 ovalbumin-특이 IgG 의 F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체 역가 측정 ···························· 30
1. 마우스 혈청 내 사람 IgG 에 특이적인 마우스 IgG 항체 역가 비교 ·································· 30
2. 사람 IgG 의 F(ab')2 분절 분리 ················· 33
3. 사람 IgG 의 F(ab')2 분절에 대한 마우스 IgG 항체 역가 비교 ·································· 34
4. 사람 ovalbumin-특이 IgG 의 F(ab')2 분절에 특이적인 마우스 IgG 항체 역가 비교 ························ 36
Ⅳ. 고찰 ································ 38
Ⅴ. 결론 ································ 44
참고문헌 ······························· 45
