The Activators of Dendritic Cells
- 주제(키워드) Spleen Dendritic cells , Bone-marrow-derived Dendritic Cells , Inotodiol , Fibronectin , s-ICAM-1 ,
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 Jong Young Kwak
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032160
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
The Activators of Dendritic Cells Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells and effective activators of naive T lymphocytes. They serve as a link between innate and adaptive immunity. The ontogeny and functions of DC subsets are diverse and proven to potentially take up and potentially process tumor-associated antigens (TAA). In this context, scientists have devised techniques like genetically modified or TAA-pulsed DC vaccines and immunostimulatory adjuvants or agents to block immunosuppressive DC function that can promote the activation of DC and T cell priming. Thus, efforts to combine adjuvants with antigens for in vivo applications are rising. The phenomena of spleen dendritic cells (sDCs) activating spontaneously when isolated and put in cell culture have proven intriguing. Freshly isolated sDCs are immature, having low MHC and co-stimulatory molecules. However, significant activation occurred in culture as early as 3 hours. The most important observation is that most of the up-regulation of maturation factors happens due to cell-cell interactions. This cell clustering enables soluble ICAM-1 to be shed, which increases the up-regulation of maturation surface molecules such as CD86, CD80, CD40, MHCI, and MHCII. Furthermore, fibronectin and fibronectin cell-binding domain peptides, but not laminin and its cell-binding domain peptides, suppress sDCs cell aggregation and activation without affecting cell survival. The findings indicate a potential technique for using primary spleen dendritic cells in cancer immunotherapy research. The extracellular matrix (ECM) plays a dynamic role in shaping a cell's survival, differentiation, and migration. The ECM and DCs cooperate in finely tuned, dynamic exchanges that subsequently affect the homeostasis between steady-state DC tissue residence or DC-stimulated inflammation. It is important to elucidate how DCs maintain homeostasis. It was then investigated whether the ECM proteins, such as fibronectin (FN) and laminin (LMN) proteins, affect the maturation of bone marrow-derived DCs (BMDCs). Fibronectin inhibited the expression of surface maturation marker CD86 in a dose-dependent manner compared to untreated cells or laminin-treated BMDCs. Moreover, the production of pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-12p40 in LPS-induced BMDCs was dose-dependently inhibited by fibronectin compared to LPS alone. Additionally, fibronectin abrogated the phosphorylation of AKT and IKKα/β but not p38 and ERK1/2 Kinases in LPS-stimulated DCs. Upon using integrin inhibitors like BIO5192 (α4β1 inhibitor) and PF-562771 (FAK inhibitor), FN's inhibitory activity was disrupted because it is most likely that FN inhibition began with binding to the α4β1 integrin receptor and then phosphorylated FAK, resulting in AKT kinase dephosphorylation. The decreased expression of FN in the LPS-injected mouse spleen also proved that FN solely regulated dendritic cell activation and migration. These results suggest that Fibronectin and laminin ECM proteins have a different impact on the phenotypic or functional properties of matured DCs. In the search for DC adjuvants for cancer immunotherapy, Inotodiol from Inonotus obliquus, a natural compound with a wide range of biological activities, was investigated. It was explored whether it promotes the maturation of bone marrow-derived DCs (BMDCs) and inotodiol-treated BMDCs induce T cell activation. Inotodiol increased the expression of surface maturation markers, including MHC-I, MHC-II, CD86, and CD40, on BMDCs without affecting the production of various pro-inflammatory cytokines. T cells primed with inotodiol-treated BMDCs proliferated and produced IL-2 without producing other cytokines. Injection of inotodiol into mice induced maturation of splenic DCs and IL-2 production. The administration of inotodiol and inotodiol-treated BMDCs induced the proliferation of adoptively transferred CD8+ T cells in vivo. The phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor wortmannin abolished the upregulation of Akt phosphorylation and CD86 and MHC-II expression caused by inotodiol. However, inotodiol failed to induce phosphorylation of the IκB kinase and degradation of IκB-α, and increased expression of CD86 induced by inotodiol was not blocked by an IκB kinase inhibitor. These results suggest that inotodiol induces an atypical maturation in DCs through phosphatidylinositol-3-kinase activation but not through NF-κB, and inotodiol-treated DCs enhance T cell proliferation and IL-2 secretion. Overall, these findings raised critical theoretical issues that have a bearing on the dendritic cells' maturation, functionality in the presence of fibronectin, and a promising strategy to utilize primary sDCs as a platform for cancer immunotherapy.
more초록/요약
수지상 세포의 활성화제 수지상 세포는 전문적인 항원 제시 세포이며, naive T 림프구의 효과적인 활성화제이다. 그들은 선천적 면역과 적응적 면역 사이의 연결고리 역할을 한다. DC 하위 집합의 개체 발생과 기능은 다양하며 종양 관련 항원(TAA)을 잠재적으로 수용하고 처리하는 것으로 입증되었다. 이러한 맥락에서 과학자들은 DC 및 T 세포 priming의 활성화를 촉진할 수 있는 면역 억제 DC 기능을 차단하기 위해 유전자 변형 또는 TAA pulsed DC 백신 및 면역 자극 보조제 같은 기술을 고안했다. 따라서, 생체 적용을 위해 보조제와 항원을 결합하려는 관심이 증가되고 있다. 비장 수지상 세포(sDC)가 분리되어 세포 배양에 투입될 때 자발적으로 활성화되는 현상은 주목받고 있다. 새롭게 분리된 sDC는 미성숙하고, 낮은 MHC와 공동 자극 분자를 가지고 있다. 그러나 비장 수지상세포의 자발적 활성화는 배양 3시간 안에 일어난다. 가장 중요한 부분은 대부분의 성숙 인자의 상향 조절이 세포-세포 상호작용에 의해 일어난다는 것이다. 이는 수용성 ICAM-1을 흘려 보내어CD86, CD80, CD40, MHCI, MHCI와 같은 성숙 표면 분자의 상향 조절을 증가시킨다. 또한 피브로넥틴, 특히 피드로넥틴의 세포 결합 도메인은 세포 생존에 영향을 주지 않고 세포 응집과 활성화를 억제한다. 하지만 라미닌은 그 역할을 하지 못한다. 이 연구결과는 암 면역요법 연구에 1차 비장 수지상 세포를 사용할 수 있음을 기대한다. 세포 외 기질(ECM)는 세포의 생존, 분화, 이동을 형성하는 데 중요한 역할을 한다. ECM과 DC는 미세 조정된 동적 교환에서 협력하며, 이는 이후 정상 상태의 조직 상주DC 또는 염증 자극된DC 사이의 항상성에 영향을 미친다. DC가 어떻게 항상성을 유지하는지 설명하는 것이 중요하다. 따라서 피브로넥틴(FN) 및 라미닌(LMN) 단백질과 같은 ECM 단백질이 골수 유래 DC(BMDC)의 성숙에 영향을 미치는지 여부를 조사했다. 대조군, 라미닌 처리 BMDC 와 비교하여 피브로넥틴이 처리된 BMDC는 용량 의존적인 방법으로 표면 성숙 마커 CD86의 발현을 억제되었다. 또한 LPS 유도 BMDC에서 TNF-α 및 IL-12p40과 같은 염증성 사이토카인의 생성은 LPS 단독과 비교하여 피브로넥틴에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 피브로넥틴은 LPS 자극 DC에서 AKT와 IKKα/β의 인산화를 억제했지만, p38과 ERK 1/2 키나아제는 유의미한 반응을 보이지 않았다. BIO5192(α4β1 저해제) 및 PF-562771(FAK 저해제)과 같은 인테그린 억제제를 사용하였을 때, FN의 억제 활성은 α4β1 인테그린 수용체에 결합하는 것으로 시작하여 phosphorylated AKT 키나아제 탈인산화가 일어났다. LPS 주사 마우스 비장에서 FN의 발현의 감소는 FN이 수지상 세포의 활성화와 이동을 단독으로 조절한다는 것을 증명했다. 이러한 결과는 피브로넥틴과 라미닌 ECM 단백질이 성숙 DC의 표현형 또는 기능 특성에 다른 영향을 미친다는 것을 시사한다. 암 면역요법을 위한 DC 보조제를 찾기 위하여 천연 화합물 Inonotus obliquus로부터 다양한 생물학적 활성을 가진 Inotodiol을 선발하였고, Inotodiol처리에 따른 골수유래 수지상세포(BMDC)의 성숙을 촉진여부와 BMDC의 T세포 활성화 유도 능력을 확인하였다. Inotodiol은 다양한 염증성 사이토카인의 생성에 영향을 미치지 않고 BMDC에서 MHC-I, MHC-II, CD86, CD40을 포함한 표면 성숙 마커들의 발현을 증가시켰다. Inotodiol 처리 BMDC로 활성화된 T 세포는 다른 사이토카인을 생성하지 않고 증식하여 IL-2를 생성한다. 생쥐에 Inotodiol을 주입하면 비장 DC의 성숙과 IL-2 생산이 유도된다. Inotodiol과 Inotodiol 처리된 BMDC의 투여는 생체 내에서 양쪽으로 전이된 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다. The phosphatidylinositol-3-kinase저해제 wortmannin은 Inotodiol에 의한 Akt 인산화 및 CD86 및 MHC-II 발현의 상향 조절을 억제했다. 그러나 Inotodiol 은 IκB 키나아제의 인산화 및 IβB-β의 분해에 영향이 없었고, Inotodiol에 의해 유도된 CD86의 발현 증가는 IβB 키나아제 억제제에 의해 차단되지 않았다. Inotodiol 이 The phosphatidylinositol-3-kinas활성화를 통해 DCs에서 비정형 성숙을 유도하지만 NF-κB를 통해서는 유도되지 않으며, Inotodiol이 처리된 DCs는 T세포 증식과 IL-2 분비를 향상시킨다는 것을 시사한다. 이를 바탕으로 수지상 세포의 성숙, 피브로넥틴 존재에서의 기능, primary sDC를 암 면역 치료의 플랫폼으로 활용하는 유망한 전략과 관련된 중요한 이론적 문제를 제기한다. 키워드: 골수 유래 수지상 세포, 이노토디올, 피브로넥틴, s-ICAM-1, 비장 수지상 세포
more목차
Chapter 1: Introduction 1
1.1 Dendritic Cell Origin, Diversity, and Function 1
1.2 Dendritic Cell in Cancer Immunotherapy 5
1.3 Fibronectin and Laminin 8
1.4 Interplay between Fibronectin and Dendritic Cells 11
1.5 General Objectives 13
1.6 Scope and Limitations of this study 14
Chapter 2: General Materials and Methods 16
2.1 Materials and Reagents 16
2.2 Differentiation of Bone-marrow derived Dendritic Cells 16
2.3 Purification of peritoneal macrophages and culture of Raw264.7 cells 23
2.4 Flow Cytometry 23
2.5 Enzyme-linked immunosorbent assay 24
2.6 Western blot 24
2.7 Quantitation of Dextran uptake 25
2.8 Quantitation of apoptosis and necrosis 25
2.9 Real-Time PCR Quantitation 26
2.10 Statistical Analysis 26
Chapter 3: Spontaneous Activation of sDCs 28
3.1 Introduction 28
3.2 Experimental Section 30
3.2.1 Isolation of Spleen Dendritic Cells from C57BL6/J mice 30
3.2.2 Culture Methods of Spleen Dendritic Cells 30
3.2.3 OT-1 CD8+ T cell proliferation assay 31
3.2.4 Flow cytometry using Cytek Aurora 31
3.2.4.1 High dimensional analysis of flow cytometry data using UMAP 34
3.2.5 Dot Blot Analysis 35
3.2.6 Adoptive Transfer of Spleen Dendritic Cells 35
3.3 Results and Discussion 36
3.3.1 Maturation markers of sDCs up-regulate on culture over time 36
3.3.2 Fibronectin downregulates maturation markers of cultured sDCs 40
3.3.3 Soluble Intercellular Adhesion Molecule 1 as an activator of dendritic cells Maturation 45
3.3.4 Functional Analysis of FN-treated sDCs 49
3.4 Summary 55
Chapter 4: Fibronectin abrogated the LPS-treated BMDCs maturation 56
4.1 Introduction 56
4.2 Experimental Section 58
4.2.1 Isolation and activation of Bone-marrow derived Neutrophils 58
4.2.2 BMDCs treatment with LPS and ECM proteins 58
4.2.3 Immunocytochemistry 59
4.2.4 Scanning electron microscope 59
4.2.5 In vitro fibronectin degradation assay 60
4.2.6 BMDCs treatment with BIO5192 and PF-562771 60
4.2.7 Immunohistochemical staining and immunofluorescence 60
4.2.8 Western blot 62
4.2.9 Neutrophil depletion 63
4.3 Results and Discussion 65
4.3.1 Fibronectin inhibits LPS-treated BMDCs maturation 65
4.3.2 Signaling pathway of fibronectin inhibition in LPS-BMDCs 69
4.3.3 Neutrophil augments the production of the fibronectin-degrading protease in vitro and in vivo 73
4.3.4 Neutrophils serve as the initiator of spleen dendritic cells activation 78
4.4 Summary 81
Chapter 5: Inotodiol Promotes Dendritic Cell Atypical Maturation 83
5.1 Introduction 83
5.2 Experimental Section 87
5.2.1 Inotodiol extraction and purification 87
5.2.2 BMDC stimulation with Inotodiol 88
5.2.3 Mixed Leukocyte Reaction (MLR) assay 88
5.2.4 OT-1 CD8+ T cell proliferation assay 88
5.2.5 Analysis of CD86 Expression in CD11c+ Splenic DCs and Cytokine Production in Inotodiol-injected Mice 89
5.2.6 In vivo CD8+ T cell proliferation assay 90
5.2.7 Western Blot 91
5.3 Results and Discussion 93
5.3.1 Purification of inotodiol and synthesis of its derivatives 93
5.3.2 Inotodiol increases the expression of MHC and co-stimulatory molecules 95
5.3.3 Inotodiol induces atypical BMDCs phenotype 98
5.3.4 Inotodiol-BMDCs trigger T cell proliferation 102
5.3.5 Effect of Inotodiol on spleen dendritic cells and IL-2 production in vivo 105
5.3.6 Effects of Inotodiol and Inotodiol-BMDCs on transferred CD8+ T cells In vivo 109
5.3.7 Effect of Inhibitors on CD86 and MHC-II expression in Inotodiol-BMDCs 113
5.3.8 Signaling pathway of Inotodiol-BMDCs 115
5.4 Summary 120
Chapter 6: General Conclusion and Outlook 124
6.1 General Conclusion of the Dissertation 124
6.2 Recommendations for Future Work 126
References 127
Appendices 140
Korean Abstract 177
