Engineering of EpCAM-targeting cyclic peptide and a U-box of E3 ligase E4B by yeast surface display
- 주제(키워드) EpCAM , Cyclic peptide , E4BU , E3 ligase
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032140
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
암과 같은 질병을 치료하기 위한 목적으로 사용되는 치료약물의 표적 특이성은 치료 시 효과 못지않게 중요한 요소다. 일반적으로 질환 세포의 경우 정상 세포에서 유전자적, 단백질적 변이에 따라 발생하는 것으로, 서로 간에 많은 공통적 단백질을 가지고 있다. 따라서 표적 세포는 바람직하지 않은 부작용을 피하기 위해서는 질환 세포 특이적으로 정확하게 처리되어야 한다. 그동안 세포 특이적 약물 전달 접근법에 대한 많은 연구가 있었지만, 아직까지 정확한 정답은 존재하지 않고, 계속적으로 표적 특이적 수용체의 필요성이 이야기되고 있다. 본 연구는 세포 유형 특이성을 증가시키기 위한 고리형 펩타이드의 개발과, 세포 내부의 단백질을 제거하기 용이한 E3 연결효소를 엔지니어링하는 데 초점을 맞추고 이 두 가지 결과물을 이용하여 암을 비롯한 질병을 치료하기 위해 개발된 단백질의 사용법을 탐구한다. 본 연구에서는 항체에 종양세포 특이성을 부여하기 위해 효모표면표시 기술을 사용하여 EpCAM 수용체에 대해 특이성과 고친화성을 가지는 ep6 고리형 펩타이드를 개발했다. 개발된 ep6 고리형 펩타이드를 활성화된 Ras와 특이적으로 결합하는 항체(ep6Ras37)와 융합하고 발현을 위해 정제하였을 때, 물리적, 생물학적 기능의 저하가 발견되지 않았고, 야생형의 Ep133 펩타이드와 비교하여 EpCAM에 대한 친화력이 약 10배 증가하였다. 또한 ep6Ras37를 이용한 생체 내 실험에서 ep6Ras37은 EpCAM 수용체를 발현하는 Lovo 암세포를 이종 이식한 마우스 모델에서 종양 표적능 및 종양 내부의 축적이 증가했음을 확인하였다. 이후 E2-유비퀴틴 복합체(E2-Ub)와 상호작용하고 알로스테릭 자극을 통해 유비퀴틴 전달을 향상시키는 유비퀴틴 E3 연결효소인 E4BU(#8)를 설계했다. 이는 베이스로 사용된 E4BU(NT)에 비해 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화 속도를 증가시키는 것을 확인하였다. 추가 실험을 통해 E4BU(#8) 단백질의 E3 라이게이즈로써, 표적 단백질로의 유비퀴틴 전달 속도가 E4BU(NT)과 비교하였을 때, 약 3배 빠르다는 것이 확인되었다. 위에서 연구된 EpCAM 수용체를 표적하는 고리형 펩타이드, ep6와 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화 속도가 증가된 E4BU(#8)를 적용하는 방법을 설계하였다. 설계된 치료용 항체의 목적은 치료용 항체의 경쇄부분의 N 말단과 C 말단에서 각각 ep6 고리형 펩타이드와 E4BU(#8)를 융합하는 것이다. ep6와 E4BU(#8)이 융합된 치료용 항체는, ep6 고리형 펩타이드를 통해 종양 세포를 인식하며, 엔도좀 탈출능을 통해 세포 내부에 위치한다. 항체의 중쇄 특이적으로 표적 단백질에 결합할 수 있으며, E4BU(#8)에 의해 매개되는 폴리유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 통해서 세포 내부의 표적 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는 기작을 가질 것으로 예상한다. 세포 내부의 특정 표적 단백질을 제거하는 기술이 개발되면 효과적인 종양 치료로 이어져 세포독성 등 부작용을 줄일 수 있다. 즉, 대상 단백질의 분해를 유도할 수 있는 E3 ligase인 E4BU(#8)의 개발과 함께 종양특이적 수용체인 EpCAM을 표적화할 수 있는 고리형 펩타이드를 사용한 치료용 항체의 개발은 새로운 질병 치료법 개발로 이어질 수 있을 것이고, 추가적인 연구를 통해 보다 더 효율적인 치료용 항체의 개발이 가능 할 것으로 전망한다.
more초록/요약
The specificity of a therapeutic reagent to a target is a factor that is as important as its effects when treating diseases such as cancer, since cancer cells are indistinguishable from normal cells. Thus, the target cells must be treated precisely such that undesirable side effects are avoided. Although there have been many studies on cell-specific drug delivery approaches, an investigation of the target-specific moiety is still required for many receptors. This study focuses on the engineering of a cyclic peptide and an E3 ligase to increase cell-type specificity and explores the possible usage of these engineered proteins to treat cancer. In Chapter 2, I engineered an EpCAM-specific, high-affinity ep6 cyclic peptide using yeast surface display technology to impart tumor cell specificity on antibodies (Abs). When the engineered ep6 cyclic peptide was fused to Ras-targeted Ab (ep6Ras37) and purified for expression, the affinity for EpCAM was increased about ten times compared to Ep133 peptide alone without a decrease in biophysical properties. Furthermore, ep6Ras37 showed increased tumor homing and accumulation in a xenografted mouse model of EpCAM-expressing cancer cells. In Chapter 3, I engineered E4BU (#8), a ubiquitin E3 ligase that interacts with the E2-Ubiquitin complex (E2-Ub) and enhances its ubiquitin transfer through allosteric stimulation. This resulted in increased polyubiquitination rate of the target proteins compared to E4BU(NT). Further experimentation confirmed that the ubiquitin transfer rate was three times faster than that of E4BU(NT). In Chapter 4, a method for applying the EpCAM-targeted cyclic peptide, ep6, and the E4BU (#8) was designed. The purpose of this study was to fuse ep6 and E4BU (#8) at the N-terminus and C-terminus of the cell to penetrate antibody (Ab) light chain (LC) with reduced HSPG binding activity and increased productivity. The fusion protein specifically recognizes tumor cells through the ep6 cyclic peptide and is localized inside of the cell through endosomal release. Through EpCAM-mediated endocytosis, it can escape by cell penetration, bind to target proteins, and allow for polyubiquitination and proteasomal degradation mediated by E4BU (#8). The development of technology that allows for removal of specific target proteins inside cells can lead to effective tumor treatments, reducing side effects such as cytotoxicity. In other words, engineering a cyclic peptide that can target the tumor-specific receptor, EpCAM, in conjunction with developing E4BU (#8), a ligase that can induce ubiquitination of the target protein, can possibly lead to the development of novel disease treatments.
more목차
CHAPTER 1. General introduction 1
1.1 Disease and cancer therapy 1
1.2 Need for targeting ligands that specifically target diseased cell/tissues 3
1.3 Ubiquitin-Proteasome System (UPS) 5
CHAPTER 2. Engineering of an EpCAM-targeting cyclic peptide to improve the EpCAM-mediated cellular internalization and tumor accumulation of a peptide-fused antibody 10
2.1 Abstract 10
2.2 Introduction 11
2.3 Materials and Methods 13
2.3.1 Protein expression and purification 13
2.3.2 Generation and screening of EpCAM-targeted ep133 peptide library using yeast surface display 13
2.3.3 ELISA and SPR 14
2.3.4 Size exclusion chromatography (SEC) 14
2.3.5 Cell lines 15
2.3.6 Confocal immunofluorescence microscopy 15
2.3.7 Biodistribution imaging in vivo 15
2.3.8 Statistical analysis 15
2.4 Results 17
2.4.1 Affinity maturation of EpCAM-targeted cyclic peptide using yeast surface display 17
2.4.2 Engineering of the EpCAM-targeting peptide to improve biophysical properties of the peptide-fused Abs 20
2.4.3 High-affinity EpCAM-targeting peptide-fused Abs possess an improved cytosol-penetrating ability 23
2.4.4 The high-affinity EpCAM-targeting peptide-fused Ab shows enhanced tumor homing and accumulation 25
2.5 Conclusion 27
CHAPTER 3. Engineering a U-box of E3 ligase E4B through yeast surface display-based functional screening generates a variant with enhanced ubiquitin ligase activity 28
3.1 Abstract 28
3.2 Introduction 29
3.3 Materials and Methods 30
3.3.1 Protein expression and purification 30
3.3.2 Yeast surface display of E4BU and ubiquitination assays 30
3.3.3 Generation and screening of E4BU(NT) library using yeast surface display 31
3.3.4 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 31
3.3.5 Size Exclusion Chromatography (SEC) 32
3.3.6 In vitro ubiquitination assay 32
3.3.7 Statistical analysis 32
3.4 Results 33
3.4.1 Establishment of a functional screening system of E4BU using yeast surface display 33
3.4.2 Ub ligase activity-based screening of E4BU variants using yeast surface display 36
3.4.3 Construction and characterization of vhhGFP4-E4BU fusion proteins 37
3.4.4 vhhGFP4-E4BU(#8) exhibits improved ubiquitination activity for the GFP target 39
3.4.5 vhhGFP4-E4BU(#8) exhibit faster Ub ligase activity in vitro 43
3.5 Conclusion 45
CHAPTER 4. Development of therapeutic antibodies that induce degradation of cytosolic proteins 46
4.1 Abstract 46
4.2 Introduction 47
4.3 Materials and Methods 48
4.3.1 Cell lines 48
4.3.2 Antibody Construction of full-length human IgG cytotransmab and iMab 48
4.3.3 Expression and purification of antibody 48
4.3.4 Confocal immunofluorescence microscopy 48
4.4 Results 50
4.4.1 Engineering cytotransmab LC to minimize the HSPG-binding activity 50
4.4.2 Intracellular protein degradation strategy using cell penetrating antibody 53
OVERALL CONCLUSION 55
REFERENCES 56
ABSTRACT IN KOREAN 60
