Development of monoclonal antibodies against coat protein of soybean yellow mottle mosaic virus
- 주제(키워드) SYMMV , Anti-SYMMV coat protein antibody , SpyTag , Diagnostic kit
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 권명희
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000032032
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV) was first discovered in Korea. This virus infects legumes and reduces yields. Infected plants develop yellow mosaics on their leaves but are sometimes asymptomatic. SYMMV infection has been conventionally diagnosed using PCR. However, this method is slower than the antibody-based diagnostic method, making it difficult to effectively control virus transmission. In this study, monoclonal antibodies (mAbs) were developed against the recombinant coat protein of SYMMV . Six SYMMV amino acid sequences that were potential epitopes were synthesized as peptides and used as immunogens, and 43 mAbs were obtained by hybridoma technique. Eight mAbs from the ascitic fluid showed a relatively strong antigen-binding ability to the recombinant coat protein of SYMMV in ELISA using the SpyTag/SpyCatcher technology that does not require antigen purification. Two clones (1F7 and 3J2) that recognized different epitopes were selected from among the eight clones. The two mAbs purified from the hybridoma culture supernatant were bound to a different form of recombinant coat protein of SYMMV in which a chaperone was fused to the N-terminus and used in ELISA, increasing the reliability of the antigen-binding ability of the selected clones. Because there was no steric hindrance between the two mAbs in the competitive ELISA and sandwich ELISA performed with the combination of single-chain variable fragments and IgG, it is expected that the mAbs could be used in point-of-care SYMMV diagnostic kits.
more초록/요약
콩황화모틀모자이크바이러스 (SYMMV)는 국내에서 최초로 발견된 콩과 식물을 감염시키는 바이러스로, 작물 수확량 감소를 유발한다. 감염된 개체는 이파리에 황색 모자이크가 나타나는 병증을 보이며 증상이 없이 감염이 되기도 한다. 현재 SYMMV 감염의 진단에는 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR) 기법이 주로 사용되지만, 항체기반 진단방법보다 시간이 오래 걸리기 때문에 효과적으로 바이러스 전파를 통제하기 어렵다는 단점이 있다. 본 연구에서는 신속한 진단을 통하여 바이러스 전파를 막기위해 항체기반 진단방법 중 하나인 측면유동성분석법 (Lateral flow assay; LFA)에 적용할 수 있는 단클론 항체를 개발하였다. 개발에 필요한 시간을 줄이기 위해, SYMMV의 아미노산 서열 중 항원결정기로 적용 가능할 것으로 예상되는 6가지 서열을 펩타이드로 합성하여 쥐에 대해 면역원으로 사용하였고 하이브리도마 기법을 통해43가지의 단클론 항체 (monoclonal antibody)를 얻었다. 항원 단백질의 정제가 필요없는SpyTag/SpyCatcher 기술을 이용하여 C-말단에 SpyCatcher 단백질이 융합된 재조합 SYMMV 외피 단백질로 단클론 항체를 포함하는 쥐의 여러 복수 (ascitic fluid)를 스크리닝한 결과, 8개의 클론이 비교적 강한 항원 결합 능력을 보였다. LFA는 동일 항원의 서로 다른 부위에 동시에 결합하는 두가지 항체가 필요하기 때문에, 서로 다른 항원결정기를 인식하는 2개의 클론 (1F7 및 3J2)을 선택하였다. 하이브리도마 세포의 배양상청액으로부터 정제한 두 단클론 항체를 N-말단에 샤페론 단백질이 융합된 재조합 SYMMV 외피단백질에 대해 간접 ELISA를 수행한 결과, 두 단클론 항체 모두 양성 신호를 보여 스크리닝 결과의 신뢰도를 높였다. 두 클론의 단일사슬항체조각 (single chain variable fragment; scFv)형과 면역글로불린G (Immunoglobulin G; IgG)형을 조합하여 수행한 경쟁ELISA (competitive ELISA)와 샌드위치ELISA (sandwich ELISA)에서 두 클론 모두 동시에 재조합 SYMMV 외피 단백질과 결합하는 것을 확인했다. 따라서 두 단클론 항체가 LFA원리를 이용한 SYMMV 현장 진단 키트 개발에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
more목차
INTRODUCTION 1
MATERIALS AND METHODS 5
A. B-cell epitope prediction 5
B. Structure modeling of SYMMV CP 5
C. Production of anti-SYMMV CP mAbs secreting hybridoma cell line 6
D. Expression of SYMMV CP-SpyC and SpyC proteins in E. coli 6
E. ELISA for binding of mAbs to SYMMV CP-SpyC 7
F. Expression and IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) of trigger factor (TF)-SYMMV CP and TF 8
G. Size exclusion chromatography (SEC) 9
H. Sequence analysis of variable region gene in immunoglobulin from hybridoma cell lines. 11
I. Expression of anti-SYMMV CP single-chain variable fragment (scFv) in E. coli 11
J. Purification of IgGs and scFvs 15
K. ELISA for binding of mAbs to TF SYMMV CP 15
L. Sandwich ELISA 16
M. Ab homology modeling 16
N. Ab-antigen docking 17
O. BioLayer interferometry immunosorbent assay (BLI‑ISA) 17
RESULTS 19
A. Six peptides were selected for immunogen 19
B. SYMMV CP-SpyC is a protein antigen suitable for Ab screening that does not require antigen purification 25
C. Two anti-SYMMV CP mAbs were selected that can bind to both peptide and protein antigen 30
D. Two mAbs do not compete for the binding to SYMMV CP 36
E. Protein-protein docking of SYMMV CP-1F7,3J2 scFv 42
DISCUSSION 53
CONCLUSION 57
REFERENCES 58
