O-linked N-acetylglucosamine transferase(OGT)의 S-nitrosylation 3D-motif 분석 및 OGT 활성조절 기작에 관한 연구
A study on the S-nitrosylation 3D-motif analysis of OGT and the regulatory mechanism of OGT activity
- 주제(키워드) S-Nitrosylation , O-GlcNAcylation , OGT
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 도수일
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031910
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
단백질 S-nitrosylation은 posttranslational modification(PTM)으로 기질단백질의 시스테인에 Nitric Oxide(NO)가 공유결합이 일어나 S-nitroso-proteins을 생성하는 과정이다. SNO-단백질의 NO는 NO 합성효소(NOS1, NOS2, NOS3)의 활성을 통해 생성되며, intra-, inter- 및 transnitrosylation 과정을 거쳐 시스테인 잔기로 전달된다. S-nitrosylation은 다양한 조직이나 세포에서 발생하며, 단백질의 활성이나 단백질 localization, 단백질 구조 안정성을 조절한다. 대부분의 단백질은 시스테인 잔기를 가지고 있으나, NO와 결합하는 시스테인 잔기는 굉장히 선택적으로 국한되어 있다. NO와 결합하는 시스테인의 특성을 찾기 위해 시스테인 잔기 주변의 Acid-Base motif, Aromatic 잔기 및 소수성 성질을 나타내는 아미노산들과 원자들 간의 거리, 입체적인 위치 등을 수치화하고 통계적 분석을 통해 S-nitrosylation이 일어나는 시스테인 잔기와 일어나지 않는 시스테인 잔기들을 구별하여 새로운 S-nitrosylation 3D-motif를 제시하고자 한다. 다음으로 O-GlcNAcylation은 N-acetylglucosaminyltransferase(OGT)가 단백질의 세린 또는 트레오닌의 수산기(-OH기)에 GlcNAc을 수식하는 것이다. OGT의 기능은 방어 기작, 신호조절자 및 인산화의 경쟁과 같은 다양한 측면과 관련되어 있다. O-GlcNAcylation은 Hexosamine Binding Pathway(HBP)에 의해 의존되며, N-acetylglucosaminidase(OGA)의 활성에 의해 조절된다. 단백질 S-nitrosylation과 O-GlcNAcylation은 중요한 PTM으로 알려져 있으나, 서로간의 생물학적 연관성은 명확하게 알려진바 없다. 이번 연구에서 heat-shock에 의한 S-nitrosylation과 O-GlcNAcylation의 상관관계를 파악하고자 한다. ex-vivo, in-vitro상의 heat-shock을 통해 hypo-S-nitrosylation과 hyper-O-GlcNAcylation간의 역 유도 현상을 설명하고자 한다.
more초록/요약
Protein S-nitrosylation(SNO-proteins) is a posttranslational cysteine(Cys) modification with NO in which NO is covalently linked to Cys thiols on target proteins, finally generating S-nitrosoproteins(SNO-proteins). In SNO-proteins, NO is produced enzymatically via NO synthase(NOS1, NOS2, and NOS3) activity, and is transferred to specific Cys residues under NO diffusing locally via multilayered complex process, such as intra- and inter-transnitrosylation. S-nitrosylation occurs in various tissues and cells, and regulates protein activity, protein localization, and protein structural stability. Most proteins contain cysteine residues, but NO-binding cysteine residues are highly selective. In order to find the characteristics of cysteine that binds to NO, the acid-base motif around the cysteine residue, the aromatic residue, and the distance between the amino acids and atoms and the three-dimensional position of the hydrophobic properties are quantified and the cysteine in which S-nitrosylation occurs through statistical analysis. We propose S-nitrosylation 3D-motif of proteins by distinguishing between SNO-Cys residues and UM-Cys residues. Next, Protein O-GlcNAcylation is Ser/Thr-linked O-GlcNAc modification catalyzed by Nacetylglucosaminyltransferase(OGT). Functionality of OGT have been involved in diverse aspects, such as defensive tactics, signaling modulators, and phosphorylation competitors. Status of OGlcNAcylation largely depends on hexosamine biosynthetic pathway(HBP), and in situ OGT activity together with N-acetylglucosaminidase(OGA) activity. Protein S-nitrosylation(SNO-proteins) and OGlcNAcylation are important posttranslational modifications. Biological connection between SNO and O-GlcNAcylation is not clear. Here, we investigate biological connection between SNO and OGlcNAcylation and provide the mechanistic evidence for inverted induction of hypo-SNO and hyperO-GlcNAcylation during heat-shock
more목차
제 1 장 단백질 S-nitrosylation(SNO-proteins) 3D –motif 분석 1
1.1. 서론 1
1.2. 재료 및 방법 4
1.2.1. OGT-Cys 1차서열에서의 산성, 염기성 및 방향족 아미노산 탐색 4
1.2.2. OGT-Cys 3차구조상의 주변 아미노산 탐색 4
1.2.3. Kyte-Doolittle Hydropathy plot을 이용한 OGT-Cys의 3D-Hydropathy score 분석 4
1.2.4. S-nitrosylated proteins(PDB file) 수집 5
1.2.5. DeepView/swiss-Pdb Viewer을 이용한 단백질 구조 분석 5
1.2.6. Amino acid score을 이용한 protein SNO-3D-motif Score 분석 6
1.2.7. F검정, t-검정을 통한 SNO-Cys와 UM-Cys의 유의성 분석 7
1.3. 결과 8
1.3.1. OGT-Cys 1차서열에서의 산성, 염기성 및 방향족 아미노산 탐색 8
1.3.2. OGT-Cys thiol기 기준 3차구조상의 7Å이내 주변 아미노산 탐색 8
1.3.3. Kyte-Doolittle Hydropathy plot을 이용한 OGT-Cys의 3D-Hydropathy score 분석 14
1.3.4. OGT SNO-3D-motif를 포함한 SNO-단백질들의 SNO-Specificity 탐색 15
1.3.5. OGT SNO-3D-motif의 다른 SNO-단백질들로의 확장 16
1.3.6. 206개 SNO-단백질들의 thiol기 기준 7Å이내 주변 아미노산 탐색 16
1.3.7. 206개 SNO-단백질들의 3D-Hydropathy score 분석 17
1.3.8. 3D-Hydropathy score에 thiol기와 아미노산 간의 거리를 포함한 protein SNO-3D-motif Score 분석 18
1.3.9. protein SNO-3D-motif score을 통한 SNO-Cys, UM(Unmodified)-Cys 두 집단의 통계적 유의성 분석 19
1.4. 고찰 21
1.5. 참고문헌 87
제 2 장 Heat-shock에 의한 hypo-S-nitrosylation & hyper-O-GlcNAcylation 연구 92
2.1. 서론 92
2.2. 재료 및 방법 94
2.2.1. 시약 94
2.2.2. 조직 준비 및 ex vivo heat-shock 처리 94
2.2.3 세포 배양 및 in vitro heat-shock 처리 94
2.2.4. Biotin-switch assay 95
2.2.5. Immunoblot 분석 96
2.2.6. OGT 활성 측정 96
2.2.7. OGA 활성 측정 96
2.3. 결과 및 고찰 98
2.3.1. Ex vivo heat-shock 동안의 hyper-O-GlcNAcylation 유도 98
2.3.2. Ex vivo, in vitro 조직 및 세포들의 heat-shock에 의한 hypo-S-nitrosylation과 hyper-O-GlcNAcylation 유도 98
2.3.3. Ex vivo heat-shock에서 조직들의 OGA 활성 측정 99
2.3.4. Ex vivo에서 조직들과 in vitro에서 세포들의 내인성 SNO-단백질들의 SdeNO 탐색 99
2.4. 고찰 및 결론 101
2.5. 참고문헌 108
Abstract 113
