노화성난청 세포 모델에서 Atorvastatin 처리를 통한 소포체 스트레스 감소 및 세포사멸 억제 기전 규명
The effect of Atorvastatin on auditory cell models for age-related hearing loss via suppression of endoplasmic reticulum stress and apoptosis
- 주제(키워드) Atorvastatin , 노화성난청 (age-related hearing loss) , 세포 노화 (cellular senescence) , 소포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress) , TFEB (transcription factor EB) , 리소좀 (lysosome) , 자가포식 (autophagy) , 세포사멸 (apoptosis)
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 정연훈
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031809
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Research background: The endoplasmic reticulum (ER) contains about one-third of the protein produced in all eukaryotic cells. ER stress occurs as a result of protein unfolding and misfolding. or excessive protein accumulation. With aging, protein insolubility and accumulation increase, which is thought to be an inevitable consequence of aging and may affect both the lifespan and diseases of aging (e.g., neurodegenerative diseases). This study investigated the correlation between ER stress and the process of age-related hearing loss (ARHL), and confirmed the effect (and mechanisms thereof) of atorvastatin. Methods: CBA/J male mice (age, 6 months; n = 12) were maintained under standard animal house conditions. Auditory thresholds were measured using the auditory brainstem response (ABR; 8, 16, 32 kHz) at 6 and 26 months. We established ARHL at 26 months. As young controls, 6-month-old male mice (n = 12) were used. The mice were sacrificed and analyzed by hematoxylin and eosin (H&E) staining and immunohistochemical (IHC) studies. For in vitro studies, HEI-OC1 cells were treated with low-dose doxorubicin (DOXO, 100 ng/mL), thapsigargin (TG, 0.5 μM), or atorvastatin (AS, 0.5 μM). Results: Using the ABR to confirm ARHL, the ABR threshold shift increased significantly by 25 dB at 8, 16, and 32 kHz. The Western blot and IHC analyses showed an increase in CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) and decrease in transcription factor EB (TFEB), which are markers of ER stress. For the in vitro model of ARHL, HEI-OC1 cells were treated with DOXO to induce premature senescence. A decrease in TFEB, increased lysosome damage, and autophagy inhibition were observed in the premature senescent cell model, as in the animal model. When ER stress was induced by TG in normal cells, TFEB decreased and nuclear migration was inhibited. ER stress activated mammalian target of rapamycin (mTOR), which promoted TFEB phosphorylation. Increased TFEB phosphorylation via immunoprecipitation increased ubiquitination, which was reflected in increased ubiquitin K48 levels under ER stress. The increased ubiquitin expression stimulated the ubiquitin-proteasome-dependent degradation of TFEB. Atorvastatin upregulated TFEB by reducing ER stress (p-JNK, p-eIF2α, and CHOP) in premature senescent cells, and activated autophagy by reducing lysosome damage. Atorvastatin also suppressed unfolded protein response (UPR)-mediated apoptosis by decreasing ER stress (p-eIF2α and CHOP) via an increase in HSF1 in the ER stress-induced group. Atorvastatin inhibited mTOR activity by reducing ER stress via HSF1 and caused the accumulation of TFEB. Increased TFEB activated lysosome biogenesis and autophagy. Autophagy was activated due to decreased lysosome damage, in turn due to a reduction in ER stress and increased lysosome biosynthesis with increasing TFEB. Therefore, ARHL should be prevented by reducing auditory hair cell loss via reduced UPR-mediated apoptosis and autophagy activation due to TFEB. Atorvastatin should also prevent ARHL by inhibiting UPR-mediated apoptosis, thereby reducing auditory hair cell loss and activating autophagy via an increase in TFEB. Conclusions: In this study, ER stress increased with aging, which caused UPR-mediated apoptosis, reduced TFEB, and induced the inhibition of autophagy due to lysosome damage. As a result, ER stress may be one of main causes of ARHL. Atorvastatin is thought to inhibit UPR-mediated apoptosis by suppressing ER stress, and to prevent ARHL by activating autophagy via TFEB.
more초록/요약
소포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress, ER stress)는 노화성난청 발병 원인 중 하나로, 노화과정동안 발생하는 소포체 스트레스를 억제 시 청력보호 효과가 보고된 바 있다. 콜레스테롤 합성 억제제인 atorvastatin은 본연의 기능 외 다양한 항산화 유전자 및 단백질 발현을 증가시켜, 달팽이관 조직 내 활성산소와 산화스트레스를 감소시키고, 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 노화성난청 과정에서 atorvastatin 처리를 통해 소포체 스트레스 억제 효과와 관련기전을 조사하여 atorvastatin에 의한 소포체 스트레스 매개 노화성난청 예방 메커니즘을 밝히고자 하였다. 연구 수행결과 노화성난청 달팽이관 조직에서 소포체 스트레스가 발생함을 UPR (unfolded protein response) 마커인 CHOP (C/EBP homologous protein), p-eIF2ɑ (eukaryotic initiation factor 2ɑ) 단백질 발현증가로 확인했다. 더불어 LAMP1 (lysosomal-associated membrane protein 1)과 Galectin-3그리고 LAMP1과 LC3B (microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B)의 발현 위치를 통해 리소좀 (lysosome) 손상과 자가용해소체 (autolysosome) 가 축적되어 자가포식 (autophagy)이 억제됨을 관찰하였다. 이는 청각유모세포를 이용한 스트레스 유도 조기노화세포 (stress-induced premature senescence) 및 thapsigargin 처리를 통해 소포체 스트레스를 유발한 노화성난청 모방 세포모델에서 동일하게 관찰되었다. 또한, 조기노화세포모델과 소포체 스트레스 유도 모델에서mTOR (mammalian target of rapamycin)활성이 리소좀과 자가포식의 신호전달 조절인자인 TFEB의 인산화를 증가시켜 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (ubiquitin–proteasome system)을 통해TFEB 분해를 촉진하는 것으로 관찰하였다. 그러나 atorvastatin처리 시, 소포체 스트레스 감소로 mTOR 활성을 억제하여 TFEB 인산화를 감소시켜 분해를 억제함을 관찰하였다. 더불어 리소좀 합성 증가 및 손상 감소를 통해 자가포식 활성을 유도하고 지속적인 소포체 스트레스의 감소로 세포사멸 (cleaved caspase-3) 또한 감소하는 것을 관찰하였다. 종합적으로 본 연구결과들을 통해 기존 보고된 문헌과 같이 노화과정 중 발생되는 소포체 스트레스가 노화성난청의 발병인자 중 하나임을 다시 확인하였다. 그러나 atorvastatin 처리 시 노화과정에서 발생하는 소포체 스트레스로 인한 UPR 매개 세포사멸 활성인자인 CHOP 감소와 TFEB 활성을 증가시켜 리소좀 손상을 감소시키고 정상적인 자가포식을 유지하여 세포 생존에 기여하는 것으로 관찰하였다. 따라서 본 연구를 통해 atorvastatin을 통한 노화성난청 예방 기전과 치료 타깃에 대한 일부 단서를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
more목차
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 실험 재료 및 방법 13
1. 생체 내 실험 (In vivo study) 13
A. 실험동물 (Animals) 13
B. 청성 뇌간 반응 (Auditory Brainstem Response, ABR) 13
C. 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry) 14
D. 조직 균질화 (Tissue homogenization) 14
2. 생체 외 실험 (In vitro study) 15
A. 세포 배양 (Cell culture) 15
B. 세포 균질화 (Cell homogenization) 15
C. Doxorubicin (DOXO) 처리를 통한 조기노화세포 모델링 16
D. 소포체 스트레스(ER stress) 발생 세포 모델링 16
E. Atorvastatin 처리 방법 16
F. 면역세포화학염색 (Immunocytochemistry) 17
3. 웨스턴 블랏 (Immunoblot) 17
4. 면역 침강 (Immunoprecipitation) 18
5. 통계적 분석(Statistical analyses) 18
Ⅲ. 결과 19
1. 생체 내 실험 (In vivo study) 19
A. 노화성난청 달팽이관 조직의 표현형 조사 19
a. 노화성난청 모델 확립 및 조직의 형태학적 분석 19
b. 소포체 스트레스 및 UPR 신호기전 분석 21
c. 리소좀 및 자가포식 관련 마커의 조직 내 발현 분석 23
2. 생체 외 실험 (In vitro study) 25
A. In vivo 모델을 모방한 조기노화세포에서 표현형 조사 25
a. 소포체 스트레스 매개 UPR, TFEB, HSF1, 리소좀 및 자가포식 관련 단백질 발현 분석 25
b. 소포체 스트레스 매개 UPR, TFEB, 리소좀 및 자가포식 관련 마커의 세포 내 발현 분석 27
B. HEI-OC1 세포에서 Atorvastatin 효과 조사 29
C. 조기노화세포에서 Atorvastatin 효과 조사 31
a. 소포체 스트레스 매개 UPR, 리소좀 및 자가포식, HSF1 관련 단백질 발현 분석 31
b. 소포체 스트레스 매개 UPR, TFEB, 리소좀 및 자가포식 관련 마커의 세포 내 발현 분석 33
D. Thapsigargin처리를 통한 소포체 스트레스 유도 세포에서 조기노화세포의 결과 검증 35
E. 소포체 스트레스 유도 세포에서 atorvastatin 효과 조사 37
a. 소포체 스트레스 매개 UPR, TFEB, 리소좀 및 자가포식, mTOR 관련 단백질 발현 분석 37
b. 소포체 스트레스 매개 UPR, TFEB, 리소좀 및 자가포식 관련 단백질들의 세포 내 발현 분석 39
F. 소포체 스트레스 매개 세포사멸에서의 atorvastatin의 효과 조사 42
G. 소포체 스트레스에 의한 TFEB 감소 기전 조사 44
Ⅳ. 고찰 48
Ⅴ. 결론 51
참고문헌 52
