Trophic relations of terrestrial consumers in tundra and temperate ecosystems based on fecal DNA
- 주제(키워드) Blocking primer , Fecal dietary analysis , Food webs , Temperate forest , Trophic relation , Tundra ecosystem
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박상규
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031723
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
야생동물의 먹이원 분석은 종간의 영양 관계를 연결하고 먹이 그물을 이해하고, 더 나아가 생태계의 에너지 흐름을 설명하는데 중요하다. 또한 야생동물의 먹이원에 대한 정보는 그 종과 생태계의 보전 및 관리를 위한 기반이 된다. 최근에는 먹이원 파악을 위해 배설물 DNA를 기반으로 한 비침습적 접근법이 널리 사용되고 있다. 본 연구에서는 육상 생태계, 특히 툰드라와 온대 생태계의 영양 관계를 밝히기 위해 배설물 DNA를 기반으로 세가지의 관련된 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구는 블로킹 프라이머(blocking primer)와 클로닝(cloning)이 먹이원 분석을 위한 유용한 도구임을 보여준다. 배설물 DNA를 기반으로 한 효율적인 먹이원 분석을 위해 북극여우와 담비에 대한 블로킹 프라이머를 제작하여 각 포식자 DNA가 증폭되는 것을 방지하였다. 3´-말단이 3-carbon spacer (C3-spacer)로 변형된 블로킹 프라이머는 reverse 프라이머가 DNA 주형에 결합하는 것을 방해한다. PCR 진행 시, 블로킹 프라이머의 최적 결합(annealing) 온도와 최적 농도를 찾아보았다. 북극여우의 블로킹 프라이머인 VulpesB와 담비의 블로킹 프라이머인 MartesB의 적정 결합(annealing) 온도는 각각 55℃와 60℃였다. 최적 농도는 범용 프라이머의 20배였다. 블로킹 프라이머를 먹이원 분석에 적용하였을 때, 목표한 포식자의 서열은 배설물 시료에서 전혀 검출되지 않았고, 먹이원의 검출 비율이 증가하였다. VulpesB을 사용하였을 때, 검출되지 않았던 3개의 먹이 분류군을 분석할 수 있었다. 또한 MartesB는 MartesB 없이 검출되지 않았던 새로운 5가지 먹이 분류군을 분석하였다. 또한, 클로닝 기반의 먹이원 분석의 효율성을 확인하기 위해, 담비와 삵의 하나의 배설물 시료에서 검출될 수 있는 먹이 분류군의 최대값을 추정하는데 희박곡선을 사용하였다. 먹이 분류군의 수는 선별된 클론의 수가 증가함에 따라 축적되었다. 담비와 삵의 한 배설물에서 검출될 수 있는 최대 먹이 분류군은 각각 3.28개와 3.38개로 추정되었고, 세번째 먹이 분류군은 각각 네번째와 다섯번째 클론에서 검출되었다. 따라서 다음의 먹이원 분석 연구에서 세개 이상의 클론이 기본적으로 선별되었으나, 몇 개의 클론은 염기서열 분석에 실패하였다. 이러한 결과로 클로닝 기반의 먹이원 분석 결과가 야생동물의 먹이원 구성을 설명할 수 있다고 결론지었다. 두 번째 연구에서는 배설물에서 추출한 DNA를 분석하여 노르웨이 스발바르 군도의 Kongsfjorden 인근 툰드라 생태계에서 주요종들의 먹이원을 규명하고 이들의 영양 관계를 파악하기 위한 먹이원 분석을 수행하였다. 초식동물의 배설물에서 식물 DNA를, 북극여우의 배설물에서 척추동물의 DNA를 증폭하고 클로닝 및 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 먹이원을 분석하였다. 북극여우의 경우, 첫번째 연구에서 제작한 블로킹 프라이머를 사용하여 먹이원 DNA의 검출을 향상시켰다. 연구지역의 초식 동물인 흰뺨기러기, 스발바르순록, 바위뇌조는 특별한 선호도 없이 화본형, 광엽초본, 기는 줄기의 식물을 섭식하는 것으로 보인다. 이끼는 모든 초식 동물의 중요한 먹이원으로 나타났다. 또한 흰뺨기러기와 버드나무속(Salix) 사이의 먹이 관계가 새로 연결되었다. 포식자 수준에서 북극여우는 오리과(Anatidae)와 갈매기과(Laridae)와 같은 조류를 선호하였다. 세 번째 연구에서는 점봉산의 온대생태계에서 육상 포유류의 영양관계를 파악하기 위해 포유류의 배설물에서 먹이원을 분석하였다. 육식동물의 경우, 블로킹 프라이머를 사용하여 클로닝 및 생어 염기서열 분석 통해 먹이 DNA 염기서열을 검출하였다. 점봉산에서는 담비와 삵의 분변에서 참새목과 닭목 등의 다양한 조류와 설치류가 높은 빈도로 검출되었으며, 이들은 육식동물의 중요한 먹이로 판단된다. 담비와 삵은 연구 지역에서 최상위 포식자로 보인다. 여러 잡식동물의 배설물 시료에서 다양한 먹이 분류군이 검출되었으며, 족제비는 육식 성향이 컸고 오소리는 초식 성향에 더 가까웠다. 초식동물의 경우, 고라니는 벼과와 장미과의 식물을 선호하였고 멧토끼는 단향과와 참나무과를 선호하였다. 본 연구는 블로킹 프라이머와 배설물의 DNA를 이용한 클로닝 기반의 먹이원 분석법을 사용하여 툰드라 및 온대 육상 생태계의 주요종 간의 영양 관계를 파악하였다. 생태계의 먹이 그물을 추정하고 에너지 전달을 이해하려면 다양한 종의 다수의 배설물 시료에 대한 장기적인 연구가 필요 할 것으로 보인다. 이러한 연구로 각 종의 먹이 선호도의 계절적 변화와 지역적 차이 또한 확인할 수도 있다. 추후 연구에서 NGS (Next Generation Sequencing) 기법을 사용하여 보다 더 정량적인 먹이 선호도와 먹이 그물을 파악할 예정이다. 또한 연구된 동물들의 조직에 대한 질소 안정 동위원소 분석을 진행한다면 각 종의 영양 위치를 추정할 수 있다.
more초록/요약
Diet analysis is an important research tool for connecting trophic relations and understanding food webs, further, elucidating the energy flow of ecosystems. Recently, non-invasive approaches based on DNA from feces have been widely used for dietary analysis. To elucidate trophic relations of terrestrial ecosystems, especially tundra and temperate ecosystems, I conducted three related studies based on fecal DNA. The first study suggested that blocking primer is a promising tool for dietary and trophic analyses. For efficient dietary analysis based on fecal DNA, I designed blocking primers for Arctic fox (Vulpes lagopus) and yellow-throated marten (Martes flavigula) to prevent from amplifying each predator DNA. The blocking primers prevent annealing of the universal reverse primer. After optimization of annealing temperature and concentration of blocking primers for Arctic fox (VulpesB) and yellow-throated marten (MartesB), respectively, the designed blocking primers were used for dietary analysis. As results, targeted predator DNA were not detected from fecal samples at all, and detection rates of prey DNA were increased. In addition, I attempted to test the efficiency of cloning-based dietary analysis. Rarefaction curves were used to estimate the total number of prey taxa detected from a single fecal sample of the yellow-throated marten and leopard cat. The maximum number of prey taxa were estimated as 3.28 and 3.38, respectively for yellow-throated marten and leopard cat. In my results, third taxa were detected at the fourth and fifth clones, respectively. Thus, three or more clones were basically selected and sequenced in following studies, however, some clones failed to be sequenced. It suggested that cloning-based dietary analysis could properly represent diet compositions of mammals. In the second study, dietary analysis were conducted to elucidate the diets of major animals and understand their trophic relations in tundra ecosystems near Kongsfjorden by analyzing DNA extracted from feces. Plant DNA was detected in the feces of herbivore and vertebrate DNA was detected in the feces of Arctic fox by amplifying, cloning, and Sanger sequencing. In case of Arctic fox, VulpesB, the blocking primer designed in the first study, was used to improve the detection of their prey DNA. Herbivores were described as feeding on graminoids, forbs, and prostrate as well as moss, without specific preference in study area. In addition, a missed link between barnacle goose and Salix, not mentioned in previous studies, was connected. At the predator level, Arctic fox preferred birds such as geese (Anatidae) and gulls (Laridae). In the third study, the diets of terrestrial mammals were analyzed to understand their trophic relations in temperate ecosystems in Mt. Jeombongsan. Prey DNA was detected in feces by cloning-based Sanger sequencing and using blocking primers in case of carnivore. In study area, a variety of rodents and birds such as Passeriformes and Galliformes were frequently detected in feces of yellow-throated marten and leopard cat, suggesting that the taxa were considered as important preys for Carnivora. The results showed that yellow-throated marten and leopard cat were top predators, feed on larger animals than the predator, in study area. Based on food items detected in feces omnivores, Siberian weasel have hypercarnivorous tendency while Asian badger have hypocarnivorous tendency. Family Lepidoptera were identified in fecal samples of various rodents. In addition, Poaceae and Rosaceae were most detected plants in feces of Korean water deer, Santalaceae and Fagaceae were frequently detected in feces of Korean hare in study area. In summary, blocking primers, designed in this study, successfully prevent targeted predator DNA, appearing to be useful for dietary analysis of carnivore. This study examined trophic relations among major species in tundra and temperate terrestrial ecosystems based on fecal DNA, through cloning-based dietary analysis using the blocking primers.
more목차
Chapter 1. General Introduction 1
Chapter 2. Methodology to improve diet analysis of carnivore based on fecal DNA 5
I. Introduction 6
II. Materials and methods 12
1. Design of blocking primers for Arctic fox (Vulpes lagopus) and yellow-throated marten (Martes flavigula) 12
1.1. Preparation of control DNA and sequence data 12
1.2. Design of blocking primers 15
1.3. Optimization of PCR conditions 16
1.3.1. Annealing temperature 16
1.3.2. Test of concentration of blocking primers 17
1.4. Application of blocking primers to dietary analysis of Arctic fox and yellow-throated marten 18
2.Validity of cloning-based dietary analysis 19
III. Results 20
1.Design of blocking primers for Arctic fox (Vulpes lagopus) and yellow-throated marten (Martes flavigula) 20
1.1. Design of blocking primers 20
1.2. Optimization of PCR conditions 24
1.2.1. Annealing temperature 24
1.2.2. Test of concentration of blocking primers 29
1.3. Application of blocking primers to dietary analysis of Arctic fox and yellow-throated marten 32
1.3.1. Preliminary test of blocking efficiency of blocking primer, VulpesB 32
1.3.2. Preliminary test of blocking efficiency of blocking primer, MartesB 34
2. Validity of cloning-based dietary analysis 37
IV. Discussion 40
Chapter 3. Trophic relations based on fecal DNA in tundra terrestrial food webs near Kongsfjorden, Svalbard, Norway 44
I. Introduction 45
II. Materials and methods 48
1. Study site and sample collection 48
2. Dietary analysis 48
2.1. DNA extraction 48
2.2. PCR for herbivores 50
2.3. PCR for Arctic fox 50
2.4. Cloning and sequencing analysis 51
III. Results 53
1. The number and amplification success rate of fecal samples 53
2. Dietary analysis 55
2.1. Diets of herbivores 55
2.2. Diets of Arctic fox 58
IV. Discussion 60
Chapter 4. Trophic relations based on fecal DNA in temperate terrestrial food webs in Mt. Jeombongsan, Korea 67
I. Introduction 68
II. Materials and methods 72
1. Study site and sample collection 72
2. Dietary analysis 76
2.1. DNA extraction 76
2.2. PCR for dietary analysis 76
2.3. Cloning and sequencing analysis 79
2.4. Rarefaction analysis of prey in feces of yellow-throated marten and leopard cat 79
III. Results 80
1. The number of collected fecal samples 80
2. Frequency of occurrence of diets in feces 83
2.1. Diets of yellow-throated marten 83
2.2. Diets of leopard cat 87
2.3. Diets of omnivores 92
2.4. Diets of herbivores 95
3. Trophic relations among terrestrial mammals of Mt. Jeombongsan 99
IV. Discussion 103
Chapter 5. Conclusions 112
References 115
Appendix 132
국문요약 134
