MG1141A as a highly potent monoclonal neutralizing antibody against SARS-CoV-2 variants
- 주제(키워드) SARS-CoV-2 , monoclonal antibody , spike protein , neutralizing antibody
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031605
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Since the coronavirus disease outbreak in 2019, several antibody therapeutics have been developed to treat severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infections. Antibody therapeutics are effective in neutralizing the virus and reducing hospitalization in patients with mild and moderate infections. These therapeutics target the spike protein of SARS-CoV-2; however, emerging mutations in this protein reduce their efficiency. In this study, we developed a universal SARS-CoV-2 neutralizing antibody. We generated a humanized monoclonal antibody, MG1141A, against the receptor-binding domain of the spike protein through traditional mouse immunization. We confirmed that MG1141A could effectively neutralize live viruses, with an EC50 of 92 pM, and that it exhibited effective Fc-mediated functions. Additionally, it retained its neutralizing activity against the alpha (UK), beta (South Africa), and gamma (Brazil) variants of SARS-CoV-2. Taken together, our study contributes to the development of a novel antibody therapeutic approach, which can effectively combat emerging SARS-CoV-2 mutations.
more초록/요약
우리는 SARS-CoV-2를 효과적으로 중화하는 항체를 개발하기 위하여노말 mouse 면역과 COVID-19 완치자의 혈액을 통한 스크리닝 방법을 활용하였다. 노말 mouse 면역을 통해 가장 specific 한 boosting 이 일어난 마우스의 spleen과 COVID-19 완치자 중 높은 serum antibody titer를 보유하고 있는 완치자 8명의 PBMC로부터 각각 variable gene을 확보하였다. 확보한 variable gene을 사용하여 mouse, human scFv phage display library를 각각 구축하였다. Immuno tube에 코팅된 Spike ECD 와 RBD에 대하여 panning을 통해 mouse scFv 항체 5종, human scFv 항체 99종을 확보하였고, 확보한 scFv는 human IgG1-kappa 와 fusion 하여 chimeric, fully human IgG1 format으로 각각 제작하여 Expi293F 세포에서 발현 및 정제하였다. 정제 완료 한 chimeric, fully human IgG1 항체를 SARS-CoV-2 authentic virus에 대하여 중화 효능 평가를 수행하였고, 이중 노말 마우스 면역에서 확보한 M4 chimeric IgG1의 EC50가 83 nM로 가장 우수하였으므로 initial candidates 로 선정하였다. M4 variable 서열은 igblast 결과 human IGHV3-21, IGKV3-15 와 가장 높은 상동성을 나타내었고 CDR-grafting을 통해 humanized 항체를 제작하였다. 일반적으로 humanization 이 후 affinity 가 감소하는 경향이 있지만, MG1141A는 오히려 기존 M4의 KD value 인 20 pM보다 10배 이상 우수한 affinity를 가지는 것을 확인하였다. 이는 framework 간의 높은 상동성으로 인하여 core residue 가 보존되어 CDR의 canonical structure 와 variable region의 전체 구조에 영향을 주지 않은 것으로 판단된다. 효능 평가 시 상대적인 비교를 위하여 현재 임상 3상 진행중인 Regeneron의 REGN10933, 10937 그리고 cocktail을 대조군으로 사용하였고, MG1141A는 in vitro 세포 중화능 실험에서 wild type과 variant들에 대하여 Regeneron의 항체와 동등한 수준의 중화능을 확인하였다. 이 중 가장 많은 변이서열이 있는 gamma variant에 대해서는 3배 정도 더 우수한 중화 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. Spike protein stable cell line을 이용하여 수행한 Fc mediated effect function 에서도 역시 ADCC & ADCP 모두 Regeneron 항체와 동등함을 확인하였다. 본 결과로 우리의 MG1141A는 Regeneron의 항체 대비 simulation docking으로 예측한 epitope이 상이하고, 또한 단일 모노클로날 항체 만으로도 동등한 수준의 우수한 in vitro efficacy를 나타내는 것을 확인하였다. 이에 따라 향후 발생될 variant에 대하여 더 효과적인 중화 효능이 기대되는 바, MG1141A는 치료용 항체의 새로운 대안이 될 수 있을 것으로 생각된다.
more목차
1. Introduction 1
2. Materials and Methods 6
2.1 Recombinant antigen expression and purification 6
2.2 Mouse immunization 7
2.3 Mouse immune library construction 8
2.4 Mouse immune library screening 9
2.5 PBMC preparation and donor screening by ELISA 10
2.6 Human germline PCR 10
2.7 Human B cell antibody library construction and screening 11
2.8 Antibody expression and purification 11
2.9 Competition ELISA assay 12
2.10 Antibody binding kinetics of antibodies toward S protein 12
2.11 Antibody binding analysis against RBD variants 13
2.12 Pseudovirus production 13
2.13 Neutralization assay with SARS-CoV-2 pseudovirus 14
2.14 Plaque assay 15
2.15 Authentic SARS-CoV-2 plaque reduction neutralization test (PRNT) 16
2.16 Generation of a cell line that expresses the spike protein of SARS-Cov-2 16
2.17 Measurement of Fc-Mediated effector functions 17
2.18 Epitope binning 17
2.19 Simulation docking 18
3. Results 19
3.1 Antigen preparation 19
3.2 Mouse immunization and selection of Anti-RBD chimeric antibodies 21
3.3 Selection of anti-SARS-CoV-2 human antibodies 24
3.4 Generation of Humanized Antibody by complementarity-determining region (CDR) Grafting 29
3.5 Binding characterization of the humanized antibody 32
3.6 MG1141A exhibits comparable neutralizing efficacy against SARS-CoV-2 WT and variants 38
3.7 MG1141A has the potential to induce Fc-mediated antibody effector functions 45
3.8 Epitope binning of MG1141A 48
3.9 Simulation docking of MG1141A with RBD 52
4. Discussion 54
REFERENCES 58
ABSTRACT IN KOREAN 65
