Role of coactosin-like F-actin binding protein 1 (Cotl1) in bone remodeling
- 주제(키워드) Cotl1 , bone remodeling , osteoclast , actin cytoskeleton , osteopetrosis
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 정선용
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031479
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Osteopetrosis is a rare skeletal disease characterized by increased bone mass resulting from impaired bone remodeling. Previous studies have shown that actin regulatory proteins play an important role in bone remodeling. The aim of this study was to investigate the role of coactosin-like F-actin binding protein 1 (Cotl1) in bone remodeling using Cotl1 knockout mice (Cotl1-/-). First, the bone properties of Cotl1-/- mice were evaluated. Although Cotl1-/- and wild type (WT) mice exhibited gradually increasing bone mineral density (BMD) with age, the BMD of the femur was higher in Cotl1-/- mice than in WT mice until week 24 of the experiment. Bone marrow cells isolated from wild-type mice and Cotl1-/- mice were examined to identify the key differentially expressed genes (DEGs) using next-generation sequencer-based RNA sequencing. Using in silico IPA pathway analysis of DEGs, many genes associated with bone metabolism, including activation of osteopetrosis and inhibition of podosome formation and osteoclast differentiation were identified. Because the identified DEGs were closely involved in osteoclast differentiation, the mRNA expression levels of the DEGs were analyzed in Cotl1-/- and WT mice-derived primary-cultured osteoclast-lineage monocytes. The 15 DEGs were significantly decreased in Cotl1-/- monocytes compared to the WT monocytes by quantitative real-time reverse transcription PCR. The plasma level of osteoclastogenic marker osteoprotegerin (OPG) was significantly increased in Cotl1-/- mice, but receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) level was significantly decreased. Furthermore, activity of a representative osteoclast differentiation marker–tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and formation of an actin ring were significantly decreased in the osteoclasts of Cotl1-/- mice. However, the osteoblast differentiation marker alkaline phosphatase activity was not different between primary-cultured osteoblasts of Cotl1-/- and WT mice. These results indicate that Cotl1 deficiency inhibited osteoclastogenesis. Next, the phenotypes of Cotl1(-/-) were investigated. Micro computed tomography of femurs showed that BMD, bone volume, and trabecular thickness were significantly increased in Cotl1-/- mice, while trabecular separation was significantly decreased. Histological images of trabecular bone in Cotl1-/- mice showed significantly reduced TRAP-positive cells. Investigation of the mechanical properties for estimating fracture risk revealed increased skeletal fragility in Cotl1-/- mouse femurs. Taken together, these results indicate that Cotl1-/- mice exhibit enhanced sclerotic bone phenotypes. This study reports that Cotl1 may play an important role in osteoclast differentiation and that Cotl1 knockout leads to an osteopetrotic phenotype in mice, suggesting that Cotl1 is a novel candidate gene involved in bone remodeling.
more초록/요약
골 재형성(bone remodeling)은 조골세포(osteoblast)의 골형성(bone formation)과 파골세포(osteoclast)의 골흡수(bone resorption)의 상호작용에 의해 조절되고 있으며, 이러한 골 재형성의 이상은 골밀도가 감소하는 골다공증(osteoporosis)과 골밀도가 증가하는 골경화증(osteopetrosis)의 발병 원인이 된다. 골 재형성에 관여하는 많은 인자들이 발견되었으며, 최근 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 관여하는 여러가지 단백질이 골 재형성에 중요한 역할을 한다는 보고가 있다. 본 연구에서는 Coactosin-유사 F-액틴 결합단백질(Cotl1)이 골 재형성에 어떤 역할을 하는지 밝히는 것을 목표로 하였으며, Cotl1 유전자 제거 생쥐(Cotl1 knockout mouse; Cotl1-/-)를 핵심 실험재료로 사용하였다. 먼저, Cotl1-/-와 야생형(wild type, WT) 마우스의 골수세포(bone marrow cell) 간에 차등 발현되는 유전자(differential expressed gene; DEG)를 발굴하는 실험을 시행하였다. 차세대염기서열분석장치(next-generation sequencer)를 이용한 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)을 통해 발굴된 DEG를 in-silico IPA pathway 분석으로 네트워크 맵(network map)을 작성한 결과, 골경화증 활성화, 포도좀 형성 및 파골세포 분화 억제 등의 골대사(bone metabolism)와 관련된 유전자가 동정되었다. 발굴된 DEG에 대한 유전자 특이적 시발체(primer) 를 사용하여 마우스 유래의 파골세포-계통의 단핵구(monocyte)에서 정량적 실시간 역전사 PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR)을 통해 mRNA 발현량을 분석한 결과, 총15종의 DEG가 WT에 비해 Cotl1-/-에서 발현이 유의하게 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Cotl1이 골대사와 관련된 기능을 한다는 것을 시사한다. 다음 실험으로, Cotl1-/- 마우스의 혈장(plasma)에서 파골세포 생성 관련 마커인 osteoprotegerin(OPG)와 receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)의 단백질 량을 측정한 결과 OPG는 증가하고 RANKL는 감소하였다. 또한, 대표적인 파골세포 분화 마커인 타르타르산 저항성 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphate; TRAP) 활성이 저해되어 있으며, 액틴 고리 (actin ring) 형성에 이상이 있음이 관찰되었다. 대조적으로, 조골세포 분화 마커인 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase; ALP) 활성은 Cotl1-/-와 WT마우스 간에 차이가 없었다. 이러한 결과는 Cotl1 소실이 파골세포 분화에 영향을 미친다는 사실을 증명한다. 끝으로, Cotl1-/- 마우스에 나타나는 뼈 관련 표현형의 변화에 대해 자세하게 조사하였다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro computed tomography) 결과에서, Cotl1-/- 마우스는 골밀도, 골 부피 및 섬유주 두께가 유의하게 증가하였고, 골간 간격이 유의하게 감소하였다. 또한, 소주골의 조직학적 분석에서TRAP 양성 세포가 현저하게 감소되어 있었다. 뼈의 물리적 특성을 조사하기 위한 3점 굽힘 테스트에서 Cotl1-/- 마우스 대퇴골에서 WT마우스에 비해 골절 취약성이 증가된 것으로 나타났다. 결론적으로, 본 연구에서 Cotl1 유전자 제거 마우스가 골경화증의 표현형을 나타난다는 사실을 처음 밝혔으며, Cotl1이 골 재형성에 관여하는 새로운 후보 인자일 가능성이 있음을 시사한다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II. MATERIALS AND METHODS 8
A. Animal experiments 8
B. Primary cell culture and osteoblast/osteoclast differentiation 8
C. Differentially Expressed Genes (DEGs) and in silico pathway analysis 9
D. Alkaline phosphatase (ALP) staining and activity assay 10
E. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and activity test 11
F. Enzyme-Linked immunosorbent assay (ELISA) 11
G. Immunofluorescence staining 12
H. Quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) 12
I. Measurement of BMD and micro-computed tomography (CT) analysis 15
J. Histological analysis 15
K. Mechanical testing 16
L. Statistical analysis 16
III. RESULTS 17
A. Differences in bone mineral density of femoral bone in Cotl1-/- mice 17
B. In silico pathway analysis of differentially expressed genes (DEGs) in bone marrow cells in Cotl1-/- mice 19
C. Analysis of the plasma levels of OPG and RANKL in Cotl1-/- mice 21
D. Effects of Cotl1 knockout in differentiation of bone remodeling cells 23
E. Actin ring formation in primary osteoclast in Cotl1-/- mice 26
F. mRNA expression levels of osteoclastic markers in Cotl1-/- mice 28
G. Structural and histological analysis in Cotl1-/- male mice 30
H. Structural and histological analysis in Cotl1-/- female and ovariectomized (OVX) mice 33
I. Examination of bone mechanical test between the femoral bone of WT and Cotl1-/- mice 36
IV. DISCUSSION 38
V. CONCLUSION 43
REFERENCES 44
국문요약 53
