Regulation of the NLRP3 inflammasome by mitochondrial MARCH5 ubiquitin ligase
- 주제(키워드) Mitochondria , MARCH5 , Innate immune response , MAVS , NLRP3
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 조혜성
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031472
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Mitochondria form tubular structure that can serve as a signaling platform in the immune system. MARCH5 locates on the mitochondrial outer membrane, and it plays a regulatory role in mitochondria quality control and signaling. In this study, I examined whether mitochondrial E3 ubiquitin ligase, MARCH5 regulates the innate immune response. To address it, I utilized a bone marrow-specific March5 knockout C57BL/6 mice generated by Cre-loxP recombination system. When I activated MARCH5fl/fl and MARCH5fl/fl:Lyz-cre BMDMs with a variety of stimuli, I observed that the NLRP3 inflammasome was selectively controlled by MARCH5. Mechanically, MARCH5 binds and transfers the K27-linked polyubiquitination to K324 and K430 of NLRP3. The MARCH5-mediated polyubiquitination on NLRP3 was critical for NLRP3 inflammasome activation. NLRP3 interacts with mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS) but MARCH5 does not affect these interactions. On the other hand, NLRP3 binding to NEK7, which is crucial for NLRP3 oligomerization step, was impaired in cells expressing NLRP3-K324R or NLRP3-K430R where Lys residue is switched to Arg on NLRP3. Together, I suggest that MARCH5-mediated NLRP3 ubiquitination is an essential step for NEK7 recruitment to NLRP3 and subsequent inflammasome activation.
more초록/요약
미토콘드리아는 세포의 항상성 유지에 있어서 중요한 역할을 하는 세포 소기관 중 하나이다. 이들은 외막에 존재하는 다양한 단백질을 조절함으로써 세포 항상성 유지에 기여한다. 단백질 조절은 다양한 번역 후 조절(Post-translational modification) 단계를 통해 이루어지게 되는데, 본 연구에서는 미토콘드리아 외막에 존재하는 E3 ubiquitin ligase인 MARCH5가 선천성 면역반응 조절에 있어서 기여하는 기능을 연구하고자 하였다. 다양한 병원균이나, 세포 내 스트레스로 인해 형성된 ROS나 mitochondrial DNA는 선천면역반응을 유발한다. 이러한 다양한 자극에 NLR신호전달에 관여하는 다양한 수용체들이 각각 인지하게 되면, ASC, pro-caspase-1과 함께 거대한 단백질 복합체(inflammasome)를 형성하여 여러 사이토카인의 분비를 증가시키게 된다. 현재까지 이들 중 NLRP3 inflammasome에 대한 연구가 가장 많이 이루어졌으며, 최근에는NLRP3 inflammasome활성화에 있어 미토콘드리아의 중요성이 강조되고 있다. 그러나 아직까지 미토콘드리아에서 어떻게 이들이 형성되는지에 대한 자세한 기전은 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 미토콘드리아에서 NLRP3복합체 형성에 있어서 MARCH5의 역할에 대해 규명하였다. 이를 위해 골수면역세포에 특이적으로 MARCH5가 결손 된 마우스를 구축하였으며, 이들의 마우스의 골수면역세포를 통해 MARCH5는 NLRP3 inflammasome을 특이적으로 MARCH5가 조절한다는 것을 확인하였다. 이는 MARCH5가 NLRP3의 NACHT 도메인에 결합하여 그곳에 있는 K324과 K430잔기에 K27 chain을 통한 폴리유비퀴틴화를 촉진함으로써 NLRP3의 자가올리고머화를 유도한다. 또한 MARCH에 의한 폴리유비퀴틴화는 NLRP3의 올리고머화를 매개하는 단백질인 NEK7의 결합을 촉진시킨다는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구는 선천면역반응에서 단백질 조절에 있어MARCH5의 역할을 positive regulator로서 확장하였고, NLRP3 inflammasome 활성화에 있어서 NEK7이 NLRP3와 상호작용하는 새로운 기전을 제시하였다.
more목차
I. INTRODUCTION 1
II. METERIALS AND METHODS 8
A. Mice 8
B. Cell culture 8
C. Isolation of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 9
D. Western blotting 9
E. Reconstitution of NLRP3 inflammasome in HEK293T cells 10
F. Immunoprecipitation 10
G. RNA interference 11
H. In vivo ubiquitination assay 11
I. GST pull-down assay 12
J. Inflammasome activation 12
K. ELISA 12
L. Cytotoxicity assay 13
M. Caspase-1 activity assay 13
N. Immunofluorescence 13
O. ASC oligomer cross-linking 14
P. Semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-age) 14
Q. Statistical analysis 15
III. RESULTS 16
A. Generation of conditional MARCH5 knock-out mouse 16
B. MARCH5 regulates NLRP3 inflammasome activation 19
C. Depletion of MARCH5 impairs the assembly of the NLRP3 inflammasome 23
D. MARCH5 interacts with the NACHT domain of NLRP3 26
E. MARCH5 promotes the K27 poly-ubiquitination of NLRP3 for inflammasome activation 30
F. MARCH5 ubiquitinates the K324 and K430 residues of NLRP3 36
G. Ubiquitination of NLRP3 by MARCH 5 facilitates NLRP3 oligomerization 40
H. The NLRP3 ubiquitination by MARCH5 does not affect the mitochondrial localization 44
I. NLRP3 ubiquitination by MARCH5 facilitates the NEK7 binding of NLRP3 for inflammasome activation 47
IV. DISCUSSION 51
REFERENCE 55
