Study on the Therapeutic Feasibility of Antibody Targeting c-Kit as Anti-Cancer Drug
항암제로서 c-Kit을 표적으로 하는 항체의 치료 가능성에 대한 연구
- 주제(키워드) c-Kit , receptor tyrosine kinase , monoclonal antibody , activating mutation , imatinib resistance , antibody-drug conjugate
- 주제(DDC) 615.1
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 박상규
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 약학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031161
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
c-Kit (CD117), a type Ⅲ receptor tyrosine kinase (RTK), plays an important role in sev-eral cellular processes, including cell proliferation, cell survival, anti-apoptosis, and differ-entiation. Binding of stem cell factor (SCF) to c-Kit triggers the intrinsic kinase activity of c-Kit, which is essential for the development of hematopoietic stem cells, melanocytes, germ cells, and mast cells. Despite its critical role in cellular processes, abnormalities in the SCF/c-Kit signaling pathway are closely related to cancers. As gene amplification-mediated overexpression of c-Kit correlates with poor clinical outcomes, c-Kit is being potential marker for cancer diagnosis and an attractive target for cancer therapy. In the first part of this paper, the development and characterization of a fully human anti-c-Kit antibody (2G4 clone ID#) were performed to target the SCF/c-Kit signaling pathway in cancer. Surface Plasmon resonance (SPR) analysis showed that 2G4 binds to human c-Kit with picomolar affinity, and cross-reacts with monkey, mouse, and rat c-Kit. Epitope mapping indicated that 2G4 binds to the Immunoglobulin (Ig)-like domains 2 and 3 in c-Kit that overlap with the SCF binding site. Furthermore, 2G4 blocked SCF-dependent proliferation and the SCF/c-Kit signaling pathway in leukemia and systemic mastocytosis cells overexpressing c-Kit. These results indicate that the 2G4 has the potential to inhibit cancer progression through inhibition of the SCF/c-Kit signaling pathway. Constitutive-activating mutation, also called gain-of-function mutation, has been fre-quently observed in c-Kit in various cancers, including acute myeloid leukemia (AML), systemic mastocytosis (SM), gastrointestinal stromal tumor (GIST), and melanoma. The activating mutations represented in the Ig-like domain 4/5, juxtamembrane (JM), and tyro-sine kinase (TK) domains of c-Kit induce not only SCF-independent growth of neoplastic cells but also imatinib resistance, resulting in poor prognosis. In the second part, the development of an antibody-drug conjugate (ADC) targeting c-Kit was performed using 2G4, a non-cleavable linker (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), and a microtubule-disrupting agent (DM1). Intact mass and SPR analyses showed that the drug-to-antibody ratio (DAR) was 1.51 and there was no difference in the binding affinity of 2G4-ADC to c-Kit com-pared to that of unconjugated 2G4 (naked 2G4). In vitro efficacy analysis showed that 2G4-ADC causes cytotoxicity through cell cycle arrest at the G2/M phase. In vivo tumor xenograft models using cancer cells harboring c-Kit activating mutation have shown that 2G4-ADC significantly regressed growth of imatinib-resistant tumors. These results sug-gest that 2G4-ADC may be used as an anti-cancer drug to overcome imatinib resistance shown in patients with constitutive-activating mutations in c-Kit.
more초록/요약
c-Kit은 타입 III에 속하는 수용체 티로신 인산화 효소로, c-Kit 세포외부 도메인에 리간드인 SCF의 결합은 다양한 어댑터 분자를 통해 하위에 위치한 단백질 인산화 효소의 활성을 촉진하여 세포 증식, 분화, 그리고 세포자살 등의 다양한 세포내 과정 조절에 중요한 역할을 한다. SCF/c-Kit은 조혈모세포, 멜라닌 세포, 생식세포 및 비만세포의 발달에 중요한 기전으로 알려져 있다. 이러한 세포 기능 조절에서의 중요한 역할에도 불구하고, SCF/c-Kit 신호전달의 이상은 암과 밀접한 관련이 있다. c-Kit 유전자 증폭에 의한 과발현은 암환자의 임상적인 예후가 좋지 않아, c-Kit은 암 진단을 위한 잠재적인 마커 및 암 치료의 표적으로 간주되고 있다. 제 1장에서는 c-Kit을 표적으로 하는 인간 단클론 항체인 2G4를 개발하였고, 다양한 분석 기법을 통해 항체의 특성을 분석하였다. 표면 플라스몬 공명 분석을 통해 인간 c-Kit 단백질에 대한 2G4 항체의 picomolar 수준의 결합력이 확인되었고, 원숭이와 쥐의 c-Kit에 대한 종간 교차 반응성을 보였다. 2G4 항체가 결합하는 항원부위는 SCF의 결합부위와 중복되는 c-Kit 세포외 도메인 2와 3으로 확인되었다. c-Kit 과발현 세포주에서 2G4 항체는 SCF가 c-Kit에 결합하는 것을 차단함으로써 SCF/c-Kit 신호 전달 억제하였다. 이러한 연구결과들을 통해, 2G4 항체는 SCF/c-Kit 신호 전달 경로를 차단하여 암세포의 증식을 억제할 수 있는 가능성을 보였다. c-Kit의 자발적 활성 돌연변이는 급성 골수성 백혈병 (AML), 전신 비만 세포증 (SM), 위장간질종양 (GIST), 흑색종 등을 포함한 다양한 암에서 관찰된다. 활성 돌연변이는 c-Kit의 juxtamembrane (JM)과 tyrosine kinase (TK) 도메인에서 주로 발견되며, SCF에 비의존적인 c-Kit 활성화를 통해 과도한 세포 증식을 유발하고, 특히 TK 도메인에서 돌연변이에 의한 구조적인 변형은 이마티닙 약물 결합을 억제하고 저항성을 유발한다. 제 2 장에서는 2G4 항체 단독 사용의 한계와 이마티닙 저항성을 극복하기 위해, c-Kit을 표적으로 하는 2G4 항체와 SMCC 비절단링커, DM1 미세소관 형성 억제제를 이용하여 항체-약물 접합체, 2G4-ADC를 제작하였고, 암 억제 효과를 확인하였다. 질량 분석을 통해 2G4-ADC는 항체 당 약물의 비가 1.51 인 것을 확인하였고, 표면 플라즈몬 공명 분석은 2G4-ADC의 인간 c-Kit 단백질에 대한 결합력이 2G4 항체와 동일함을 보였다. 2G4-ADC는 내재화 (internalization) 과정을 통해 c-Kit 활성 돌연변이를 가진 암세포내로 DM1 약물을 전달함으로써 유사분열 정지 및 세포사멸을 유도하였다. 이마티닙에 내성을 보이는 c-Kit 활성 돌연변이를 가진 암세포이종이식모델에서 2G4-ADC 투여는 통계적으로 유의미한 암 억제 효과를 보였다. 본 연구결과를 통해, 2G4-ADC는 c-Kit 활성 돌연변이에 의한 이마티닙 저항성을 극복할 수 있는 대체 항암제로 사용될 수 있음을 제시하고자 한다.
more목차
PART I : Characterization of Anti-c-Kit Antibody (2G4) 1
I. INTRODUCTION 2
II. MATERIALS AND METHODS 13
III. RESULTS 27
Ⅳ. DISCUSSION 45
Ⅴ. REFERENCES 49
Ⅵ. ABBREVIATION 53
PART II : c-Kit-Targeting Antibody-Drug Conjugate to Treat Cancers 55
I. INTRODUCTION 56
II. MATERIALS AND METHODS 68
III. RESULTS 78
Ⅳ. DISCUSSION 106
Ⅴ. REFERENCES 111
Ⅵ. ABBREVIATION 116
Ⅶ. ABSTRACT IN KOREAN 118
