Mechanism study of cytosol-penetrating antibody-mediated CMVpp65/HLA-A*02:01 complex display on tumor cells
- 주제(키워드) Cancer vaccine
- 주제(DDC) 547
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000031085
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Cancer immunotherapy has a potential and prevents humans by activating the human immune system. Most neoantigen-based cancer vaccines failed anti-tumor activity because of the lack of interaction that neoantigen interaction to immune system. In this study, I constructed a cancer vaccine in which a tumor-specific cellpenetrating antibody (Cytotransmab) was fused with an immunodominant CD8+ T cell epitope peptide of N-term, C-term extension. Proof of concept of inCT†CMV was bound specifically to the tumor surface-expressed integrin αvβ3/ αvβ5, induces internalization, and escapes from early endosome by endosomal escape motif and was delivered to the cytosol. After antibody reach cytosol in the tumor cell, immunodominant T cell epitope was generated by antigen processing pathway followed by present an immunodominant CD8+T cell epitope peptide/MHC-I complex molecule on the tumor cell surface. Therefore, I constructed only cellular antigen processing for the generation T-cell epitope, with can be loaded on the MHC I molecule. I generated inCT†CMVp480-516, effectively present CMVpp65495-503/MHC-I complex on the tumor cell surface rather than inCT†CMVp480-503 to CD8+ T cell activation in vitro and induce to antitumor efficacy in vivo. In addition, and inhibitor study was conducted to confirm the mechanism of action of the inCT†CMV. These results suggest that cancer vaccine may be only intracellular antigen processing for the generation immunodominant T cell epitope.
more초록/요약
최근 암을 치료하기 위해 암항원 (cancer antigen) 을 환자에게 여러가지 형태(DNA,RNA, peptide, whole cell lysate)로 투여하여 체내 면역반응 특히 세포 독성 T 세포 (cytotoxic CD8+ T cell, CTL) 활성화시킴으로써 암세포를 제거하고자 하는 치료용 항암백신이다. 그러나 이것은 항원을 종양 세포 표면에 전달하는 효율이 낮아 세포독성 T 세포의 활성이 억제되거나, 투여한 항원이 세포 독성 T 세포에 제대로 제시되지 않아 활성화 안되는 문제점 때문에 현재 개발되어져 있는 항암의 효능이 낮다. 또한 환자마다 이질성이 높기 때문에 개별형 백신이 주로 개발되어져 오고 있다. 이것 또한 시간이 많이 걸릴 뿐더러 비용이 많이 들고 여러 사람들에게 적용하지 못한다는 단점이 따른다. 따라서 항암백신의 효능을 높이기 위해 종양 세포를 마치 바이러스 감염된 세포로 착각하게 만들어 바이러스-특이적 T 세포가 종양세포를 공격하는 전략을 취하였다. 이때 종양 특이적 세포질 침투항체에 면역 원성을 가지는 바이러스 유래 T 세포 에피토프 펩타이드를 융합시킨 항암 백신을 구축하였다. 이때 바이러스는 전세계적으로 60~80%의 인구가 감염된 Cytomegalovirus 의 pp65 항원을 선택했으며, 면역원성이 높은 항원의 495-503번 서열을 선택했다. 이 서열은 면역원성이 높은 CD8+ T 세포 epitope이며, MHC-I 중 가장 높은 비율을 차지하는 HLA-A*02:01 유전형에 결합한다. 따라서 본연구에서는 세포질 침투항체의 C-말단에 CMVpp65유래 단백질 절편을 융합하여 암세포의 세포질에 전달하고자 하였다. 이때 이전 연구에서 구축한 항체인 inCT†CMVp480-503 은 종양 세포 표면에 발현되어 있는 MHC-I 에 peptide가 결합되는 문제점이 존재하여 추가적으로 CMVpp65 에피토프의 C-말단과 N-말단 모두 연장한 항체를 구축하여 복합체 제시 효능을 검증하여 inCT†CMVp480-516 을 선정하였다. 기존의 inCT†CMVp480-503 과 inCT†CMVp480-516 을 비교하였을 때 비슷한 수준으로 복합체가 제시 되었고 실제 마우스 모델에서 항암 효과가 나타나는지 확인 하였을 때에도 비슷한 수준으로 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 실제 항체가 세포내 항원처리 과정에 의해 복합체가 생성되는지 확인하기 위해서 작용기전을 규명하는 연구를 진행 하였고 이때, inCT†CMVp480-503은 세포 표면에 발현된 MHC-I 에 결합되지만 일부는 세포내 항원 처리 과정에 의해 복합체가 생성되어 종양세포 표면에 제시되는 것을 증명하였고, inCT†CMVp480-516 은 단지 세포내 항원 처리 과정에 의해 복합체가 종양세포 표면에 제시되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본연구를 통해 구축된 inCT†CMVp480-516 을 이용하여 종양세포가 마치 바이러스에 감염된 세포로 착각하게 만들어 바이러스-특이적인 CD8+ T 세포가 공격하는 플랫폼을 보여주었고, 여러 사람들에게 접목 시킬 수 있는 확장성을 제공한다.
more목차
1. Introduction 1
1.1 Cancer immunotherapy . 1
1.2 Antigen processing pathway 4
1.3 Human cytomegalovirus 7
1.4 Cytosol-penetrating antibody 8
1.5 Several strategies to mimic viral infection of cells 9
2. Material and methods 12
2.1 Cell lines 12
2.2 Viral peptide 12
2.3 Construction of antibody expression plasmids 12
2.4 Expression and purification of IgG antibodies 13
2.5 PBMC preparation 14
2.6 Ex vivo expansion of CMVpp65-specific CTL pool 14
2.7 Flow Cytometry 15
2.8 Confocal immunofluorescence microscopy 15
2.9 LDH release assay 16
2.10 IFN-γ release assay 17
2.11 In vivo anti-tumor efficacy using primary tumor model 18
2.12 Statistical analysis 19
3. Results 20
3.1 Construction of C-term, N-term extended CMVpp65-specific CD8+T cell epitope peptide fused cytotransmab 20
3.2 Validation of various inCT†CMV 26
3.3 CMVpp65-specific CTL pool eradication inCT†CMV clone treated tumor cells. 32
3.4 Mechanism of action of inCT†CMV 33
3.4.1 Proof of concept of inCT†CMV 33
3.4.2 inCT†CMV induced degradation by proteasome in cytosol. 34
3.4.3 CD8+ T cell epitope generate in ER by N-terminus trimming of ERAP1. 35
3.4.4 CMVpp65495-503/MHC-I complex presented through Golgi 36
3.4.5 Visualization of CMVpp65495-503/MHC-I complex in the cytosol. 37
4. Discussion 40
5. References 43
ABSTRACT IN KOREAN 45
