Development of a simple and sensitive method for assaying proteases using a pregnancy test strip
- 주제(키워드) protease , protein engineering , pregnancy test strip
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 유태현
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000030556
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
프로테아제는 체내의 다양한 세포 과정에 관여하고 이 과정을 조절하는 역할을 한다. 따라서, 이의 비정상적인 활성은 세포 과정에 이상을 일으키고 질병을 유발할 수 있다는 것이 여러 연구를 통해 밝혀져 왔다. 이러한 질병과의 연관성에 의해 질병의 진단과 예후에 이용하고자 효소의 활성을 측정하는 여러 가지 방법이 개발되었지만, 대다수의 방법에는 정교한 기기나 복잡한 절차가 수반된다. 본 연구에선 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG)을 검출하는 임신 진단 테스트기를 결과 해석에 이용하여 프로테아제의 활성을 간단하고 민감하게 측정하는 방법을 개발했다. 리포터로 사용하도록 설계된 hCG 단백질은 세파로스 구슬과 인위적인 상호작용을 할 수 있도록 설계됐고, 활성 프로테아제에 의해서만 세파로스 구슬로부터 hCG가 분리되어 방출된다. 방출된 hCG는 상업적인 임신 테스트 스트립에 의해 검출될 수 있고 검출된 신호를 통해 프로테아제를 측정한다. 위치 특이적 방식을 이용한 세파로스 구슬과 hCG의 결합, 그리고 임신 진단 테스트기의 민감성을 이용해 30분 만에 MMP-2를 picomolar 농도 범위에서 정량 분석할 수 있었다. 간단한 수정을 통해 caspase-3와 thrombin을 측정하는 시스템도 제작하였으며, 측정 시스템의 특이성 또한 확인했다. 소변 내 프로테이즈 측정도 가능했다. 이 간단한 플랫폼 기술은 다양한 질병 진단에 활용될 수 있을 것이고 높은 접근성을 제공하여 자원이 제한된 환경에서도 이용될 수 있을 것이라고 생각한다.
more초록/요약
Proteases play an important role in various cellular processes; hence, their abnormal activities are related to different diseases. Although multiple methods have been developed to measure the activities of these enzymes, a majority of them involve sophisticated instruments or complicated procedures. This study developed a simple and sensitive method to measure the activities of proteases, which is based on the pregnancy test strip detecting human chorionic gonadotropin (hCG). The hCG protein, engineered for use as a reporter, is designed to be released from the sepharose beads only when an active protease is present. In the presence of active protease, proteolytic cleavage occurs to release hCG from the sepharose beads, which can be detected by a commercial pregnancy test strip. Site-specific conjugation of hCG to the sepharose beads and the sensitivity of the pregnancy test strip allowed quantification of matrix metalloproteinase-2 in the picomolar concentration range, even though the assay time was only 30 min. Measurement of caspase-3 and thrombin was achieved through minimal modifications. Results revealed the system to be specific without any significant cross reactivity. This simple platform technology is expected to be used in the diagnosis of various diseases, providing high accessibility even in resource-constrained environments.
more목차
1. Introduction 1
1.1 Proteases as biomarkers 1
1.2 Conventional protease detection methods 2
1.3 Pregnancy test strip 3
1.4 Site-specific conjugation mtehods 6
1.4.1 SpyCatcher/SpyTag system 7
1.4.2 Unnatural amino acids 7
1.5 Aim of the study 10
2. Materials and methods 13
2.1 Construction of plasmids 13
2.2 Expression and purification of proteins 15
2.2.1 AzF-SpyCatcher 15
2.2.2 hCG-SpyTag 16
2.2.3 Caspase-3 16
2.3 Conjugation methods 17
2.3.1 Conjugation of AzF-SpyCatcher and biotin-(PEG)4-DBCO 17
2.3.2 Conjugation of biotin-SpyCatcher and hCG-SpyTag 17
2.3.3 Immobilization of hCG on sepharose beads 18
2.4 Procedure of protease assay 19
2.5 Interference test 19
2.6 Specificity test 20
2.7 Stability test 20
2.8 Detection procedure on pregnancy test strip 20
3. Results and Discussion 21
3.1 Site-specific conjugation of biotin to hCG 23
3.2 Binding of hCG and sepharose beads 26
3.3 Proteases activity assay using sepharose-hCG 28
3.4 Analysis of MMP-2 activity in biological sample 32
3.5 Validation of assay specificity 34
3.6 Stability of sepharose-hCG 36
4. Conclusions 38
5. References 40
6. Abstract in Korean 46
