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교모세포종 이종 이식 모델의 특성 분석

Characterization of orthotopic xenograft glioblastoma models

초록/요약

Glioblastoma multiforme (GBM) is a fatal malignant tumor that is characterized by recurrence and metastasis to other sites after treatment. The high recurrent and lethality of GBM patients is partly due to diffusive growth of tumor cells into the surrounding brain parenchyma, which limits curative resection of GBM. The diffusive nature of GBM and its relationship with tumor microenvironment (Stupp et al., 2005) is still unknown. To study the infiltration of GBM, two orthotopic GBM models are established in immunocompromised mice with two human glioma cell lines, U87 and LN229. U87 cells grow rapidly with demarcated boundary in vivo where as LN229 cells grow with diffusive boundary. The non-tumor cells including blood vessels, astrocytes, and microglia are analyzed in TME by immunohistochemistry. In vitro wound healing and transwell assays indicate that LN229 cells exhibit higher migration than U87 cells in the presence of soluble component of bEND cell line, an immortalized mouse endothelial cell line. Accordingly, LN229 cells migrate to a distant area where they are co-localized with blood vessels. RT- PCR analysis indicate that bEND cells express high levels of CXCL12 whereas LN229 cells express high levels of CXCR4, a receptor for CXCL12. The data suggest that the CXCL12-CXCR4 axis regulates infiltration of GBM cells. Additionally, the CD206 positive microglia in TME are abundant in LN229-bearing mice, suggesting that LN229 may induce M2-type conversion of microglia. The results suggest the intrinsic factors of GBM and their interaction with TME determine the diffusive nature and probably the responsiveness to non-cancer cells in TME. Mesenchymal stem cells are genetically modified to express a bacterial cytosine deaminase (CD). The CD enzymes convert 5-fluorocytosine (5-FC), a non-toxic prodrug into an anti-cancer drug, 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU are cell permeable and capable to suppress the growth of LN229 cells in the vicinity in vitro in a 5-FC dependent manner. When combined together, 5-FU and temozolomide (TMZ) synergistically interact and lower the IC50 of the single treatment. The MSC/CD cells are effective to suppress LN229 with even 10% of the tumor cells. Serial treatment of MSC/CD plus 5-FC and TMZ indicate the synergy of combination treatment in the orthotopic xenograft mouse model bearing the LN229 cells. The results suggest that the diffusive LN229 cells represent the grade IV GMB and combined treatment of MSC/CD and TMZ provide therapeutic potential to suppress the GBM recurrence.

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초록/요약

교모세포종은 모든 뇌종양의 15%를 차지하는 아주 치명적인 질병이다. 이러한 교모세포종 치료법에는 수술적 치료, 약물적 치료, 방사선 치료. 병용 치료 등이 시행 되고 있지만, 평균 15달 밖에 수명 연장이 되지 않으며 10%만 5년까지 사는 것을 알려져 있다. 그래서 새로운 치료법이 발견이 매우 중요한 상황이다. 교모세포종의 치료효과의 감소는 재발이 큰 부분을 차지하는데 이러한 재발은 교모세포종의 침습에 의해 주로 일어난다고 한다. 그래서 주변 조직으로 침습이 잘된다고 알려진 LN229 세포와 아닌 세포 U87세포를 이용해 비교 분석하고 그런 침습을 MSC/CD라는 줄기세포치료제로 치료가 가능한지 확인하는 실험을 하였다. 먼저 LN229세포에 GFP를 바이러스 벡터를 이용하여 형광을 띄게 한 후 암세포의 큰 특징인 성장에는 차이가 없다는 것을 확인하였다. 그리고 U87과 LN229 세포를 면역력이 없는 쥐의 뇌에 주입하여 교모세포종 모델을 만들어 보니 U87은 성장 속도는 빠르지만 뚜렷한 원으로 성장하지만 LN229은 성장이 비교적 느리지만 주변으로 퍼지는 듯한 성장을 보이며 MRI상에서도 뚜렷한 경계를 확인 하기 어려운 것을 확인하였다. 그래서 이렇게 퍼지는 LN229세포는 혈관 세포의 생성이 아닌 같이 존재하는 것을 확인 하였다. 좀 더 확실히 확인하기 위해 체외 실험을 통하여 혈관 세포인 bEnd 세포에 정말로 이동하는지 확인하기위해 상처치유 방법과 트랜스 웰 이동 방법을 이용하여 확인해본결과 U87은 자체적인 이동 능력이 LN229 보다 많이 갖고 있지만 혈관 세포로 이동하는 하지 않고 LN229 세포는 세포 외 구조를 뚫고 혈관 세포로 이동하며 그건 주로 혈관 세포가 분비하는 물질에 의해서 형성 되는 것을 확인하였다. 그리고 이것이 혈관 세포가 CXCL12를 분비하고 LN229이 수용체인 CXCR4를 많이 발현하고 있어 CXCL12/CXCR4 경로를 통해 이동하는 것을 확인 하였다. 그리고 이런 CXCR4의 상위 물질인 STAT3와 활성 상태 P-STAT3가 LN229이 U87보다 많이 발현하고 있는 것을 보아 STAT3/CXCR4/CXCL12 경로를 통해서 LN229 세포가 혈관 세포로 침습해 들어갈 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 침습에는 주변 미세 환경도 중요한 부분을 차지하는데 신경 아교 세포를 통해 다시 한번 LN229 세포가 좀더 침습 되는 것을 확인하였고 프로-인플라메이션인 신경 아교 세포가 U87에서 좀더 많이 활성화 되어 있으며 LN229에서는 안티-인플라메이션 신경 아교 세포가 증가 되어 있는 것을 확인 하여 이러한 안티-인플라메이션 신경 아교 세포도 침습에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 이런 침습이 잘되는 세포 LN229 세포가 5-FU 와 TMZ에 의해 성장이 억제 되는 것을 확인하였고 MSC/CD 줄기세포 치료제에 의해서도 성장을 억제 할 수 있는 것을 확인하였다. 5-FU와 TMZ의 병용 효과를 통해서는 LN229 세포를 좀 더 효율적을 성장을 억제 할 수 있는 것을 확인하였다. 교모세포종 모델에서의 MSC/CD와 TMZ의 병용 효과는 단독 처리 할 때보다 종양 크기를 확연하게 감소 시켰으며 생존율도 확연하게 증가 시킨 것을 확인하였다. 이를 통해 LN229세포가 STAT3/CXCR4/CXCL12 경로에 의해서 혈관 세포로 침습하며 이러한 침습 하는 세포도 MSC/CD와 TMZ의 병용 효과로 효과적으로 성장을 억제 할 수 있다.

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목차

I. INTRODUCTION 1

II. MATERIALS AND METHODS 9

1. Cell culture and transduction 9
2. In vivo xenograft mouse model 10
3. Measurement of tumor volume 10
4. Tissue preparation 11
5. Immunohistochemistry 11
6. Wound healing assay and transwell migration assay 13
7. RT-qPCR 14
8. Western blot 15
9. Cell culture and preparation of cell lines 16
10. In vitro suicide effects 16
11. In vitro bystander effects 17
12. Isobologram analysis 18
13. Statistical Analysis 19

III. RESULTS

Part A. Characterization of orthotopic xenograft glioblastoma model
1. Preparation of GFP-expressing LN229 21
2. Compare U87 and LN229 cells in orthotopic xenograft mouse model 21
3. Tumor invasion in an orthotopic animal model 22
4. In vitro assessment of GBM cell migration and invasion 23
5. TME surrounding the tumor mass of U87 and LN229 25

Part B. Combined effects of suicidal gene-expressing mesenchymal stem cells and chemotherapy in experimental glioblastoma model
1. Cytotoxic effect of 5-Fluorouracil and Temozolomide 27
2. Bystander effect of MSC/CD with 5-Flucytosine 27
3. Combination effects of 5-FU with TMZ or MSC/CD with TMZ 28
4. Therapeutic effect of MSC/CD with TMZ in xenograft mouse model 29

IV. DISCUSSION & CONCLUSION 41

V. REFERENCES 45

V. 국문요약 49

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