효모 내 퍼록시좀을 이용한 아이소프레노이드 생산 연구 : 효모 내 퍼록시좀을 이용한 아이소프레노이드 생산 연구
Harnessing yeast peroxisome for isoprenoids production in Saccharomyces cerevisiae
- 주제(키워드) Yeast , Peroxisome , Isoprenoids
- 주제(KDC) 470
- 주제(DDC) 620
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 이평천
- 발행년도 2019
- 학위수여년월 2019. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 파일정보 PDF
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000029096
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Abstract in Korean 대사공학 및 합성생물학의 발달과 함께 미생물을 이용한 천연 화합물, 약제, 및 연료와 같은 천연 물질들의 생산 기술의 중요성이 대두되고 있다. 이러한 경향은 미생물을 이용한 터페노이드, 카로틴노이드, 지베럴린, 및 진세노사이드와 같은 다양한 아이소프레노이드 물질들의 생산 연구에 박차를 가하고 있다. 그러나 미생물을 이용한 아이소프레노이드 물질의 생산은 아이소프레노이드 물질들의 특성에 따라 생산 미생물의 세포막에 축적이 이루어 지게 되며, 이는 곧 세포 성장 및 아이소프레노이드 생산에 저해를 주는 원인이 된다. 이 연구에서는 언급한 문제점을 해결하기 위해 미생물공학에서 일반적으로 이용되는 효모, Saccharomyces cerevisiae의 단일 세포막으로 이루어져 있고, 지방산 분해 대사를 수행하는 소기관인 퍼록시좀을 이용하여 세포막의 용량을 증대시키고, 기질의 효율적 사용을 유도하여 아이소프레노이드 물질들의 생산성을 향상시키는 연구를 수행하였다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 퍼록시좀의 조절 및 증대, 퍼록시좀의 조절에 따른 세포내 대사의 변화 관찰, 외래 아이소프레노이드 생합성 대사의 퍼록시좀으로의 분획화, 퍼록시좀 조절을 이용해 다양한 아이소프레노이드 물질들의 생산성 변화 확인과 같은 연구를 수행하였다. 먼저, 퍼록시좀 생성 대사에 관여하는 단백질인 페록신의 조절을 통해 다양한 형태 및 특성을 지닌 퍼록시좀을 가진 효모를 개발하였다. 효모 내 퍼록시좀의 개수 조절에 관여하는 페록신 Pex24p와 퍼록시좀의 크기 조절에 관여하는 페록신 Pex11p, 및 퍼록시좀 자기 소화 작용 대사에 관여하는 단백질은 Atg36p를 조절하여 다양한 크기와 수의 퍼록시좀의 생성을 유도하였다. 변화된 퍼록시좀의 유지 및 안정성을 형광 활성 세포 선별기(FACs)를 이용해 확인했으며, 퍼록시좀 조절에 따른 효모의 물리적 변화를 유기산 분석 및 다양한 환경 조건에서의 효모 성장 비교 분석법을 이용해 관찰하였다. 이 후, 아이소프레노이드 물질을 생산하며 세포 소기관이 조절된 효모 PPD-AA3-PX1 균주의 대사 변화를 세포 전사체 분석을 통해 확인하였다. 세포 성장 과정 중 두개의 성장 시점에서 확보한 동일한 3개의 샘플의 전체 RNA를 확보하고, 차세대 염기서열 분석법 (NGS)를 이용해 전사체 서열 정보를 확보한 다음, 효모 Saccharomyces cerevisiae CEN PK113-7D의 유전체 서열을 배경으로 PPD-AA3-PX1 효모의 전사체 변화를 분석하였다. 이를 통해 PPD-AA3-PX1 효모의 전체 대사 관점에서 발현이 증가 또는 감소된 세포 내 대사를 확인했으며, 전체 유전자 관점에서의 발현의 증가 및 감소를 분석하여 각각 상위 50개의 유전자 정보를 확보하였다. 다음으로, 아이소프레노이드 물질 중 하나인 천연 활성 스테로이드 배당체 진세노사이드의 생합성 대사를 효모 내 구축하고, 이를 퍼록시좀으로 분획화 함으로써 진세노사이드 물질 생산의 변화를 확인하였다. 진세노사이드 주요 전구체 합성 대사 단백질들인 ERG9, ERG1, PgDS, 및 PgPPDS의 퍼록시좀으로 분획화 여부를 형광 단백질과 퍼록시좀 표적화 신호 1 및 2 (PTS1 및 PTS2)를 이용해 확인하였으며, 각 단백질들의 퍼록시좀으로 분획화를 통해 진세노사이드 주요 전구체인 dammarenediol II와 protopanaxadiol의 생산량이 증대됨을 확인하였다. 마지막으로, 퍼록시좀의 인위적 조절 및 퍼록시좀으로의 대사 분획화를 다양한 아이소프레노이드 물질인 진세노사이드, 카로틴노이드, 및 지베럴린 생산에 적용하였다. 인위적 조절을 통해 크기 및 수가 증대된 퍼록시좀을 가진 효모에 진세노사이드 주요 전구체 물질인 protopanaxadiol 생합성 대사, 카로틴노이드 물질 중 하나인 -carotene 생합성 대사, 및 지베럴린 주요 전구체 물질인 ent-kaurene 생합성 대사를 구축하여 발현시킨 결과, protopanaxadiol, -carotene, 및 ent-kaurene의 생산량이 각각 210%, 130%, 및 115% 증가함을 확인하였다. 결론으로, 퍼록시좀 대사 조절 단백질인 페록신 및 퍼록시좀 자기 소화 대사 단백질의 조절을 통해 다양한 물리적 특성을 지닌 퍼록시좀의 생성을 효모 Saccharomyces cerevisiae 내에 성공적으로 유도하였으며, 퍼록시좀의 조절에 따른 효모 내 대사의 변화를 전사체 분석을 통해 확인할 수 있었다. 인위적 퍼록시좀의 조절 및 외래 아이소프레노이드 생합성 대사의 퍼록시좀으로 분획화를 통해 효모를 이용한 아이소프레노이드 물질의 생산량 증대 효과를 확인할 수 있었다. 본 연구의 주요 성과인 효모 내 퍼록시좀을 이용한 아이소프레노이드 물질의 생산 증대는 아직까지 전 세계에서 보고된 바 없는, 본 연구에서 최초로 적용 및 효과를 확인한 연구 결과이며, 이러한 결과는 퍼록시좀이라는 세포 소기관의 이해 및 대사공학 및 합성생물학 분야로의 적용을 위한 새로운 시야를 제공할 것으로 기대된다.
more목차
CONTENTS
ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………………………… i
LIST OF TABLES………………………………………………………………………………………………………………… viii
LIST OF FIGURES…………………………………………………………………………………………………………………ix
Chapter 1. General Introduction…………………………………………………………………………………………… 1
1.1 Introduction……………………………………………………………………………………………………………2
1.2 Metabolic engineering in microorganisms…………………………………………………………………… 4
1.3 Yeast engineering ………………………………………………………………………………………………… 6
1.4 Aims of This study ………………………………………………………………………………………………… 8
Chapter 2. Development and characterization of the peroxisome in Saccharomyces cerevisiae……………10
2.1 Abstract……………………………………………………………………………………………………………… 11
2.2 Introduction………………………………………………………………………………………………………… 12
2.3 Materials and Methods……………………………………………………………………………………………14
2.3.1. Strains and media…………………………………………………………………………………………………… 14
2.3.2. Plasmids construction………………………………………………………………………………………………… 14
2.3.3. Strains construction…………………………………………………………………………………………………… 15
2.3.4. Yeast cultivation……………………………………………………………………………………………………… 18
2.3.5. Batch fermentation…………………………………………………………………………………………………… 18
2.3.6. Fluorescent microscopy and image processing………………………………………………………………… 19
2.3.7. Transmission electron microscopy analysis……………………………………………………………………… 20
2.3.8. Fluorescence activated cell sorting analysis………………………………………………………………………21
2.3.6. Subcellular fractionation and isolation of peroxisomes……………………………………………………… 21
2.3.7. Metabolite analysis…………………………………………………………………………………………………… 22
2.3.8. Protopanaxadiol extraction………………………………………………………………………………………… 22
2.3.8. Protopanaxadiol analysis…………………………………………………………………………………………… 23
2.4 Results and discussion………………………………………………………………………………………………24
2.4.1. Peroxin engineering for peroxisome proliferation………………………………………………… 24
2.4.2. Isolation and quantification of peroxisome in peroxisome engineered yeast strains……… 30
2.4.3. Identification of peroxisome stability in peroxisome engineered yeast strains……………… 36
2.4.4. The effects of oleic acid in peroxisome engineered yeast strains……………………………… 41
2.4.5. The effects of peroxisome proliferation for isoprenoids production……………………………44
2.4.6. The interaction between peroxisome proliferation and oxidative stress ………………………………… 48
Chapter 3. Global transcriptome network in peroxisome engineered Saccharomyces cerevisiae ……………51
3.1. Abstract……………………………………………………………………………………………………………… 52
3.2. Introduction………………………………………………………………………………………………………… 53
3.3. Materials and Methods…………………………………………………………………………………………… 54
3.3.1. Cell culture and RNA extraction…………………………………………………………………………54
3.3.2. Pre-processing and quality assurance of the RNAseq reads………………………………………54
3.3.3. Differential gene expression analysis………………………………………………………………… 54
3.3.4. Metabolite analysis…………………………………………………………………………………………………… 55
3.3.5. Protopanaxadiol extraction………………………………………………………………………………………… 56
3.3.6. Protopanaxadiol analysis……………………………………………………………………………………………… 56
3.4. Results and discussion………………………………………………………………………………………………56
3.4.1. Preparation of total RNA for analysis of global transcriptome in peroxisome engineered strain……………………………………………………………………………………………………………………………… 57
3.4.2. Reconstruction of genome scale metabolic network in peroxisome engineered strain…… 59
3.4.3. Identification of the global transcriptional network in peroxisome engineered strain …… 66
Chapter 4. Application of peroxisome engineering for isoprenoids production in Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………………………………………………………………………………76
4.1. Abstract…………………………………………………………………………………………………………………77
4.2. Introduction……………………………………………………………………………………………………………79
4.3. Materials and Methods………………………………………………………………………………………………81
4.3.1. Strains and media…………………………………………………………………………………………………………81
4.3.2. Plasmids construction……………………………………………………………………………………………………81
4.3.3. Strain construction……………………………………………………………………………………………………… 83
4.3.4. Yeast cultivation………………………………………………………………………………………………………… 89
4.3.5. Batch fermentation………………………………………………………………………………………………………90
4.3.6. Fluorescent microscopy and image processing…………………………………………………………………… 90
4.3.7. Fluorescence activated cell sorting analysis…………………………………………………………………………91
4.3.8. Metabolite analysis……………………………………………………………………………………………………… 91
4.3.9. Ginsenosides extraction………………………………………………………………………………………………… 92
4.3.10. Carotenoids extraction…………………………………………………………………………………………………92
4.3.11. ent-kaurene extraction…………………………………………………………………………………………………93
4.3.12. Ginsenosides analysis………………………………………………………………………………………………… 93
4.3.13. Carotenoids analysis ……………………………………………………………………………………………………94
4.3.14. ent-kaurene analysis ……………………………………………………………………………………………………94
4.4. Results and discussion……………………………………………………………………………………………………102
4.4.1. Manipulation of ginsenosides precursors biosynthesis pathway………………………………… 102
4.4.2. Compartmentalization of ginsenosides precursors pathway in yeast peroxisome……………105
4.4.3. Application of peroxisome engineering for enhanced ginsenosides production…………… 108
4.4.4. Application of peroxisome engineering for the other isoprenoids production ……………… 115
5. Conclusion………………………………………………………………………………………………………………………119
6. References………………………………………………………………………………………………………………………121
ABSTRACT IN KOREAN………………………………………………………………………………………………………… 132
ACKNOWLEDGEMENT………………………………………………………………………………………………………… 135
