IP₃수용체와 Huntingtin 단백질의 정제 및 구조학적 연구
Purification and structural studies of huntingtin:IP₃ receptor
- 주제(키워드) Huntington , Huntingtin , IP₃ receptor , Protein , Protein structure
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 서민덕
- 발행년도 2019
- 학위수여년월 2019. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000028926
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Huntington‘s disease는 유전병인 퇴행성 뇌질환이다. 증상으로는 움직임이 제어가 되지 않으며, 인지 능력과 기억력이 퇴화하고 공격적인 성향을 가지게 되는 것들이 있다. 헌팅턴 병은 ‘Huntingtin’이라는 gene의 연속되는 ‘CAG’의 개수가 36개 이상으로 mutation이 일어난 경우 발병하는 질병이다. ‘Huntingtin’ 단백질의 N-terminal 부분은 총 3가지의 지역으로 구성되어 있으며, 첫째는 exon 1, 둘째는 Poly Q 지역 그리고 마지막으로 Poly P 지역으로 나누어진다. 정상인의 경우, ‘Huntingtin’은 HAP (huntingtin-associated protein)과 IP₃수용체와 함께 복합체를 이루어 Ca2+을 조절하지만 Poly Q 지역에 이상이 생겨 질병을 유발시키는 ‘Huntingtin’이 되면 IP₃수용체를 과다하게 활성화시켜 Ca2+ 을 ER에서 cytosol로 과다 분비시켜 세포 사멸에 기여하게 된다. 이러한 과정이 뇌에서 일어나게 된 경우 neuronal death로 인해 질병이 발생하게 되는 것이다. 현재까지 Huntington's disease의 확실한 치료법은 존재하지 않는다. 따라서 wild-type, pathogenic type의 huntingtin과 IP₃수용체의 복합체 구조 연구를 위해 총 4개의 단백질을 Affinity chromatography, Ion-exchange chromatography, Size-exclusion chromatography를 이용하여 순수한 target 단백질을 정제하였다. 또한 이를 가지고 Surface Plasmon Resonance (SPR)과 Isothermal titration calorimetry (ITC) 분석을 통해 in vitro 상에서 단백질 간의 상호작용을 판단하고 X-ray crystallography를 진행하여 구조 연구를 진행하였다.
more목차
Ⅰ. Introduction 1
Ⅱ. Materials and methods. 3
2.1 Materials. 3
2.2 Apparatus. 3
2.3 Methods 4
2.3.1 Purification of IP₃R1 2590-2749 4
2.3.2 Cloning and Purification of IP₃R1 2677-2733. 5
2.3.3 Purification of 17Q (wild-type), 45Q (pathogenic type). 5
2.3.4 Surface plasmon resonance (SPR) 6
2.3.5 Isothermal titration calorimetry (ITC) 6
2.3.6 Crystallization. 7
2.3.7 X-ray diffraction 8
Ⅲ. Result and discussion 9
3.1 Cloning of IP₃R 2677-2733. 9
3.2 Overexpression and Purification of IP₃ receptor fragments 11
3.2.1 Purification of IP3R 2590-2749 11
3.2.2 Purification of IP3R 2677-2733. 13
3.3 Overexpression and Purification of Huntingtin proteins 15
3.3.1 17Q (wild type of huntingtin). 15
3.3.2 45Q (pathogenic type of huntingtin). 17
3.4 Binding assay 19
3.4.1 Surface Plasmon Resonance (SPR) assay. 19
3.4.2 Isothermal titration calorimetry (ITC) analysis. 21
3.5 Crystallization and X-ray diffraction of IP₃ receptor fragments:Htt complex 25
3.5.1 17Q-Htt:IP₃R1 2677-2733 complex. 25
3.5.2 45Q-Htt:IP₃R1 2590-2749 complex 25
Ⅳ. References 28
국문초록 31
