2-Hydroxyquinoline과 4-Hydroxyquinoline의 제 1형 당뇨 억제 효과
Anti-type 1 diabetic effects of 2-Hydroxyquinoline and 4-Hydroxyquinoline
- 주제(키워드) type 1 diabetes , alloxan , ROS
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 남석현
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000028150
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
본 연구는 헤테로 고리 유기 화합물인 2-hydroxyquinoline과 4-hydroxyquinoline을 산화 스트레스를 유발하는 alloxan과 같이 rat insulinoma cell line인 INS-1 세포에 처리하여 alloxan에 의한 세포 내 손상이 감소되는지 확인하였다. 시료의 항산화 기능을 확인하기 위해 시료의 이성질체들을 추가하여 항산화 활성을 측정하였고, hydroxyquinoline의 이성질체들은 각각 항산화 활성이 다른 것을 확인하였다. 그 중 2-hydroxyquinoline과 4-hydroxyquinoline은 낮은 항산화 활성을 가지는 것으로 확인하였고, 5-hydroxyquinoline과 8-hydroxyquinoline은 높은 항산화 활성을 가지는 것을 확인하였다. 그러나 높은 항산화 활성을 가지는 시료와 alloxan을 동시에 처리하면 세포의 사멸이 증가되는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 2-hydroxyquinoline과 4-hydroxyquinoline을 alloxan과 함께 처리한 실험군에서 세포 내 활성산소의 감소를 확인하였으며, 활성산소로 인해 감소된 미토콘드리아의 막전위가 회복된 것을 확인하였다. 미토콘드리아의 막전위가 회복됨에 따라 ATP의 합성 또한 마찬가지로 회복되었음을 확인하였다. 활성산소의 감소가 2-hydroxyquinoline과 4-hydroxyquinoline에 의해 일어나는 것과 함께 각종 항산화 효소의 활성의 증가가 세포의 활성산소를 감소시킨 것으로 추측하여 항산화 효소의 활성을 확인하였다. 실험 결과 항산화 효소 중 하나인 SOD와 catalase의 활성이 증가함을 확인하였고, 이러한 현상은 세포 내부에 존재하는 활성산소와 2-hydroxyquinolin과 4-hydroxyquinoline이 반응하여 활성산소의 양이 감소하게 되고 그로 인해 효소의 활성이 증가한 것으로 확인된다. 마지막으로 세포에 과다한 활성산소의 축적으로 인해 유도되는 세포사멸 과정인 apoptosis를 확인하기 위해서 핵에서 일어나는 chromatin condensation을 DAPI 염색을 통해 확인하였다. 실험 결과 alloxan을 단독으로 처리한 실험군에서는 chromatin condensation이 일어났으나 시료와 alloxan을 동시에 처리한 실험군은 chromatin condensation이 억제된 것으로 확인되었다. 본 실험의 결과 헤테로 고리형 구조를 가진 유기 화합물인 2-hydroxyquinolin과 4-hydroxyquinoline의 항산화 기작에 의한 INS-1 세포 보호 효과를 확인하였다. 낮은 수준의 항산화 효과를 가졌지만 특정 활성산소에 특이적으로 반응하는 2-hydroxyquinolin과 4-hydroxyquinoline의 특성을 보아 hydroxyquionline은 세포 내부에서 지속적으로 자기산화/환원을 거치는 물질이 생산하는 활성산소를 효과적으로 제거하며 활성산소로 인해 발생하는 다양한 문제점을 해결할 수 있는 것으로 보인다.
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국문요약 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ ⅰ
목차 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ ⅲ
List of Figures ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ ⅵ
List of Tables ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ ⅷ
I. 서론 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 1
II. 재료 및 방법 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 5
2. 1. 시약 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 5
2. 2. DPPH 자유 라디칼 소거능 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 7
2. 3. ABTS 양이온 라디칼 소거능 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 8
2. 4. H2O2 제거 활성 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 9
2. 5. 초과산화물 소거 활성도 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 10
2. 6. Hydroxyl radical 소거 활성도 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 11
2. 7. 세포 배양 및 alloxan 처리에 의한 세포 사멸 유도‧‧‧‧‧‧‧ 12
2. 8. 세포 독성의 확인 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 12
2. 9 Alloxan 검출 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 13
2. 10. INS-1 세포에서 활성산소 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 13
2. 11. INS-1 세포에서 미토콘드리아 막전위 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 14
2. 12. 세포의 ATP 생산량 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 14
2. 13. SOD 활성도 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 15
2. 14. Catalase 활성도 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 15
2. 15. DAPI staining ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 16
2. 16. Western blot ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 16
2. 17. 통계분석 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 17
III. 결과 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 18
3. 1. Alloxan에 의한 INS-1 세포 사멸을 결정하기 위한 실험 조건검토 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 18
3. 2. INS-1 cell line에서 Hydroxyquinoline의 세포독성 확인
‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 21
3. 3. Alloxan 처리된 INS-1 cell line에서 Hydroxyquinoline의
세포 보호 효과 확인 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 23
3. 4. DPPH 라디칼 소거 활성 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 25
3. 5. 2,2′-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid
(ABTS) 양이온 라디칼 소거 활성 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 27
3. 6. 과산화수소 소거 활성 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 29
3. 7. Superoxide anion 소거 활성 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 31
3. 8. Hydroxyl radical 소거 활성 실험 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 33
3. 9. Hydroxyquinoline에 의한 alloxan의 변성 관찰 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 35
3. 10. 농도별 2-Hydroxyquinoline, 4-Hydroxyquinoline의 세포
독성 확인 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 37
3. 11. Alloxan과 2-Hydroxyquinoline, 4-Hydroxyquinoline 동시
처리 후 alloxan에 의해 유도된 세포 사멸 억제 확인 39
3. 12. INS-1 cell line에서 alloxan 유도에 의한 ROS 생산 측정
‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 41
3. 13. INS-1 세포에서 미토콘드리아 막 전위 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 43
3. 14. INS-1 세포에서의 ATP 측정 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 45
3. 15. Hydroxyquinoline에 의한 superoxide dismutase 활성의
회복 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 47
3. 16. Hydroxyquinoline에 의한 superoxide dismutase 발현
변화 확인 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 49
3. 17. Hydroxyquinoline에 의한 catalase 활성의 회복 ‧‧‧‧‧‧ 51
3. 18. Hydroxyquinoline에 의한 catalase 발현 정도 확인 ‧‧‧‧ 53
3. 19. DAPI staining을 통한 chromatin condensation 확인 ‧ 55
IV. 고찰 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 57
V. 결론 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 62
VI. 참고문헌 ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 64
Abstract ‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧‧ 71
