HDAC6 및 유비퀴틴 매개 신호전달경로에서 NEDD8의 기능적 특성 규명
Functional characterization of NEDD8 in HDAC6 and ubiquitin mediated signaling pathway
- 주제(키워드) NEDD8
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 강호철
- 발행년도 2018
- 학위수여년월 2018. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000028054
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
NEDD8(Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 8)은 81개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질로서, 전사체의 조절 및 유전체 손상/복구(DNA damage response, DDR) 기작을 포함한 세포 내의 다양한 신호전달체계에서 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 12개의 유비퀴틴유사체(ubiquitin like modifiers, ULMs)중 NEDD8은 유비퀴틴의 아미노산 서열과 60%가 완전히 일치하며 80%의 아미노산서열은 물리화학적 및 기능적 특징이 유사하다. 또한 NEDD8은 유비퀴틴과 유사하게 카르복실기 말단에 di-glycine motif를 보유하고 있다. 이러한 구조적 유사성에도 불구하고 세포 내 유비퀴틴과 NEDD8간의 기능적 차이점은 명확히 규명되어 있지 않다. 이에 본 연구에서는 human protein micro array system을 활용하여 NEDD8과 특이적으로 결합하는 단백질들(NEDD8 Interacting Proteins, SNIPs)을 동정하였으며, 이를 통해 histone deacetylase 6(HDAC6) 및 BAG3 등과 같은 선택적 autophagy와 연관된 NEDD8 결합 단백질들을 동정하였다. 이들 중 HDAC6는 프리유비퀴틴체인의 수용체로써 세포 내 유비퀴틴화된 aggregate들의 분해를 유도하는 과정에서 aggresome의 형성에 관여하는 주요 단백질로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 NEDD8이 HDAC6와의 특이적 상호작용을 통해 어떻게 세포 내 주요 신호 전달 과정에 관여하는지에 대한 연구를 진행하였다. NEDD8과 HDAC6간의 상호 결합능 분석을 위해 HDAC6 및 NEDD8의 돌연변이체들을 제작하여 실험을 진행하였으며, 이를 통해 NEDD8이 유비퀴틴과 유사한 방식으로 카르복실 말단의 di-glycine motif를 통해 HDAC6와 결합하고 있으며, HDAC6는 프리유비퀴틴체인의 결합도메인으로 알려진 BUZ/ZnF-UBP도메인을 매개로 NEDD8과 결합하고 있음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 프리유비퀴틴체인 및 NEDD8이 HDAC6의 BUZ/ZnF-UBP도메인을 매개로 상호 경쟁적으로 결합할 수 있음을 의미하는 연구 결과이다. 이 후, 프리유비퀴틴체인, NEDD8 및 HDAC6간의 상호작용에 대한 연구를 진행한 결과, 흥미롭게도 HDAC6는 프리 유비퀴틴체인 중 K63 프리유비퀴틴체인보다 K11 프리유비퀴틴체인과 보다 강하게 결합하고 있음을 확인하였으며, 이들 간의 결합이 NEDD8의해 저해되는 것을 관찰하였다. 이와 같은 결과는 NEDD8과 K11 프리유비퀴틴체인이 HDAC6와 동일한 부위에 결합하고 있음을 의미하는 것으로, 세포 내 특정 환경에 따른 각 단백질들의 양적 변화양상이 이들 단백질 간의 결합을 특이적으로 조절할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 또한 이러한 연구결과는 NEDD8이 K11 프리유비퀴티체인과 HDAC6에 의해 매개되는 세포 내 신호전달체계에서 중요한 저해제로서 작용할 수 있음을 제시하고 있다. 종합적으로 본 연구 결과는 NEDD8이 HDAC6 과 프리유비퀴틴체인의 결합을 매개로 나타나는 다양한 세포 내 신호전달 과정에서 중요한 negative regulator(음성조절자)로써 작용할 수 있음을 제시하고 있다.
more목차
차 례
국 문 요 약 ⅰ
차 례 ⅲ
그 림 차 례 ⅴ
표 차 례 ⅵ
사 용 약 어 ⅶ
Ⅰ. 서 론 1
Ⅱ. 실험재료 및 방법 6
2.1. 시약 및 재료 6
2.1.1. 동물세포 및 곤충세포 배양 6
2.1.2. 유전자 재조합 vector의 제작 6
2.1.3. 재조합 단백질의 생산 및 정제 7
2.1.4. 단백질 마이크로어레이 7
2.1.5. 항체 8
2.1.6. Western blotting 9
2.2 클론 제작 및 단백질의 정제 10
2.3 NEDD8유전자의 돌연변이 제작 12
2.4 마이크로어레이(Micro array)를 통한 binding 단백질의 스크리닝 12
2.5 면역침강반응(immunoprecipitation) 13
2.6 Western Blotting 13
2.7 Dot blot assay 14
2.8 Pull down assay 15
Ⅲ. 결과 16
3.1. 단백질 마이크로어레이를 통한 NEDD8 특이적 결합단백질들의 동정 16
3.2 단백질 마이크로어레이를 통해 동정된 NEDD8 결합단백질들의 검증 19
3.3 NEDD8과 HDAC6간의 결합 특이성 검증 22
3.4 NEDD8과 HDAC6간의 결합력 분석 27
3.5 NEDD8에 의한 HDAC6의 활성조절능 분석 30
3.6 HDAC6와 NEDD8간의 상호 결합 부위 분석. 33
3.7 NEDD8에의한 HDAC6-프리유비퀴틴체인 신호전달경로 저해기전 분석 36
Ⅳ 고찰 및 결론 39
Ⅴ. 참고문헌 44
영문요약 49
